Resumo: Biomassas vegetais são constituídas principalmente de celulose, hemicelulose e lignina. Celulose e hemicelulose podem ser hidrolisadas enzimaticamente a açúcares monoméricos (principalmente glicose/C6 e xilose/C5) usando celulases e hemicelulases, respectivamente. Hemicelulases são enzimas do grupo das hidrolases glicosídicas que catalisam a reação de hidrólise da hemicelulose em xilose e outros açúcares. A hemicelulose compõe cerca de 30% dos polissacarídeos na biomassa do bagaço de cana, contudo, poucos estudos são direcionados para melhorar a sacarificação desses polissacarídeos à açúcares monoméricos, como a xilose, que pode ser transformado em outros produtos de valor agregado como bioetanol, ácidos orgânicos e xilitol. O presente trabalho teve como objetivos a seleção de linhagens de Bacillus sp. capazes de crescer no licor de xilo-oligossacarídeos, proveniente do pré-tratamento hidrotérmico do bagaço de cana-de-açúcar, e produzir hemicelulases capazes de hidrolisar xilo-oligossacarídeos produzindo xilose a partir deste substrato. Adicionalmente, foi criada uma enzima quimérica bifuncional unindo atividades de endoxilanase e ?-xilosidase aplicada na hidrólise de xilo-oligossacarídeos para obtenção de xilose, e sua posterior fermentação para produção de xilitol utilizando as leveduras Scheffersomyces stipitis e Candida guillermondii. A partir de uma biblioteca contendo 104 isolados de Bacillus sp., foram selecionadas 7 linhagens, por meio da determinação do índice enzimático, que apresentaram a capacidade de crescer e hidrolisar os xilo-oligossacarídeos do licor. As linhagens selecionadas foram identificadas pela análise da sequência do gene RNAr 16S como linhagens de Bacillus subtilis e Bacillus licheniformis. Dentre as linhagens selecionadas, BH27 e BH93 apresentaram melhores resultados de crescimento e hidrólise e tiveram suas sequências de ?-xilosidases (GH43) clonadas, expressadas e caracterizadas, mas não foram utilizadas na construção da enzima quimérica, tendo em vista que seus parâmetros bioquímicos, e tolerância a xilose foram inferiores ou semelhantes a outras ?-xilosidases já estudadas. A enzima quimérica foi construída utilizando uma endoxilanase (M6) proveniente de evolução dirigida, e uma ?-xilosidase de Bacillus subtilis ATCC 168. Apesar de apresentar um Kcat/KM inferior ao das enzimas parentais, a construção demonstrou capacidade de hidrolisar 30% dos xilo-oligossacarídeos presentes no licor até xilose permitindo sua utilização na fermentação e obtenção de xilitol. No estudo da produção de xilitol a partir de xilose por via fermentativa foram obtidos melhores resultados utilizando as leveduras Scherffersomyces stipitis e Candida guillermondii cultivadas na forma livre, comparada com as células imobilizadas. Após 96h de fermentação em meio contendo licor de xilo-oligossacarídeos não detoxificado e enzimaticamente hidrolisado, a levedura Candida guillermondii produziu 9,5 g/L de xilitol, exibindo eficiência de conversão de 33%, um fator de conversão de 0,3 g/g e produtividade volumétrica de 0,1 g/L/h

Abstract: The plant biomasses are composed mainly of cellulose, hemicellulose and lignin. Cellulose and hemicellulose can be hydrolyzed to monomeric sugars (primarily glucose/C6 and xylose/C5) with cellulases and hemicellulases, respectively. Hemicellulases are enzymes of glycoside hydrolyses group, which catalyze the hemicellulose hydrolysis to xylose and other compounds. Hemicellulose represents around to 30% of the polysaccharide in the biomass of sugarcane bagasses. However, few studies have focused on hemicellulose saccharification for monomeric sugars production, as xylose, and then its complete conversion to value-added byproduct, such as bioethanol, organic acids and xylitol. This study aimed the selection of Bacillus sp. strains able to growth using xylooligosaccharide liquor from hydrothermal pretreatment of sugar cane bagass. Furthermore, a bifunctional enzyme (chimera) composed by an endo-xylanase and ?-xylosidase activities was constructed for the hydrolysis of xylooligosacharides to xylose and its conversion to xylitol using free and immobilized yeasts. After screening a library of 104 Bacillus sp. strains, 7 isolated were selected by the enzymatic index determination and their ability to growth in the liquor from pretreated sugarcane bagasse and hidrolyse the xylooligosacharides. The selected strains were identified by the RNAr 16S DNA sequence as being strains of Bacillus subtilis and Bacillus licheniformis. BH27 e BH93 strains showed the best results for growing and hydrolysis of xylooligosaccharides liquor and their ?-xylosidases (GH43) sequences were cloned, expressed and characterized completely. However, none of these sequences were used in the construction of the chimeric enzyme, because their biochemical parameters and xylose tolerance were lower or similar as already studied for ?-xylosidases. The chimeric enzyme was constructed using an endo-xylanase (M6) of directed evolution studies (previous works using mutagenesis) together of a ?-xylosidase from Bacillus subtilis ATCC 168. Although chimera presented a Kcat/KM lower than parental enzymes, it showed the ability to hydrolyze of 30% of xylooligosaccharides in the liquor to xylose for subsequent fermentation to xylitol. In the study of xylitol production from xylose by fermentation were obtained best results using the yeast Scherffersomyces stipitis and Candida guillermondii cultured in free form compared with immobilized cells. After 96 hours of fermentation of broth containing xylooligosaccharides liquor (non-detoxified) and enzymatically hydrolysed by chimera, the yeast Candida guillermondii produced 9.5 g /L of xylitol, showed 33% of conversion efficiency, a conversion factor of 0.3 g / g and a volumetric productivity of 0.1 g / L / hr

Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos

Orientadores: Hélia Harumi Sato, Roberto Ruller

Mestre em Ciência de Alimentos

Ciência de Alimentos

2013/10443-7

Mestrado

FAPESP