Pseudomonas aeruginosa e Acinetobacter baumannii são duas bactérias gram-negativas patogénicas altamente problemáticas em infeções hospitalares muito devido à sua capacidade de aderir a variadíssimas superfícies e formar biofilmes que contribuem bastante para o aumento da resistência aos agentes antimicrobianos, o que consequentemente potencia infeções graves em pacientes. Apesar da terapia fágica ter vindo a ser referida como uma estratégia alternativa no controlo de biofilmes, ainda há poucos estudos sobre a interação de fagos com as respetivas bactérias hospedeiras em biofilme mistos. Este trabalho descreve o efeito de fagos em biofilmes simples de A. baumannii AB1 e biofilmes mistos formados por A. baumannii AB1 e P. aeruginosa PAO1. Para este fim, foram desenvolvidos métodos de diferenciação das duas espécies no biofilme recorrendo à técnica de FISH (do inglês, Fluorescent in situ hibridization). Para uma deteção multiplex de bactérias e fagos foram desenhadas “in silico” sondas com base num novo ácido nucleico LNA (do inglês Locked Nucleic Acid), contudo só a sonda específica para a bactéria P. aeruginosa foi sintetizada e aplicada ao estudo. O método de LNA FISH para a identificação desta bactéria foi otimizado e testes laboratoriais em amostras de subespécies de Pseudomonas confirmaram os valores teóricos previstos de especificidade e sensibilidade. Os ensaios de infeção fágica contra biofilme simples de A. baumannii, mostraram que os fagos são eficientes, mesmo usando uma razão de 1 fago para 1 célula hospedeira. Com efeito, verificou-se uma redução de aproximadamente 2 log de células viáveis em biofilmes de 24 h após 6 h de contacto com o fago. Contudo a eficácia dos fagos mostrou-se significativamente superior contra células do biofilme raspado o que indica que a matriz do biofilme constitui uma barreira para a eficiente atuação do fago. Os biofilmes mistos mostraram uma predominância de P. aeruginosa em relação a A. baumannii, mesmo quando P.aeruginosa é adicionada após colonização inicial por A.baumannii. A aplicação de um cocktail formado por fagos específicos contra estas duas espécies presentes em biofilme misto revelou uma redução de 2 log de P. aeruginosa e de aproximadamente 1,5 log de A. baumannii após 6 h. No entanto, após 24 h de infeção, foi possível observar, em todos os biofilmes estudados, um aumento de células viáveis podendo este facto estar relacionado com a aquisição de resistência das bactérias aos respetivos fagos. A técnica de LNA FISH demostrou ser eficiente na discriminação clara das populações de biofilme misto, sendo um complemento na deteção / compreensão na interação dos fagos com os seus hospedeiros em estruturas complexas como os biofilmes. Em suma, este trabalho demonstrou o valor potencial dos fagos no controlo de biofilmes, tornando-se no entanto necessário progredir na presente investigação, para se definirem as condições ótimas de atuação dos fagos e as razões da diminuição da eficácia dos fagos quando em contacto com o biofilme por períodos superiores a 6 h.