The thesis based on a work performed between September 2012 and October 2013 consisted mainly in the implementation of the flow cytometry technique occurring in the enterprise Proenol - Indústria Bioetcnológica, Ltd. For this study, we resorted to the use of a multiparametric flow cytometry method, in order to characterize the yeast cells, and the fermentative kinetics, to monitor the fermentation progress. The characterization focused on the physiological properties of yeasts intending to thoroughly assess the evolution and the heterogeneity of vitality and adaptive state from their cells. The parameters monitored by low cytometry were: viable cells; metabolically active cells; intact cell membranes; neutral lipids and trehalose contents. The yeast used was Saccharomyces cerevisiae immobilized on a calcium alginate matrix, commercially identified as ProElif® for the sparkling wine production which it’s directly inoculated it into the wine. However in some specific cases, as stuck fermentation in bottle, the yeast beads of ProElif® can be previously rehydrated. The surging of a niche market which frequently applies ProElif® to restart stuck fermentations, increased the Proenol interest on the evaluation of the effects of rehydration process under the immobilized yeasts ProElif® simultaneously compare inoculation with and without yeasts rehydration in wine. The company has shown a simultaneous interest, targeted on this study, concerning to the immobilized yeast conservation properties, under the different conditions than those used at Proenol. Hence, in this study, consist on the assessment of the impact of higher temperatures to those recommended as well as the yeasts physiological condition during a conservation period of four months. Therefore, the results has shown that the rehydration proved to be a vital phase on the improvement of fermentative kinetics, achieving a faster fermentation start and reducing the time of the second fermentation. Both inoculation tests of rehydrated yeasts proved that adapted rehydration originates better results. The use of adapted rehydration solution with a nutritional supplement was beneficial to the cells, allowing them a better adaptation to the common stress conditions of rehydration and providing a second fermentation with a fast consumption of sugars without loss of viability and vitality. Finally, the conservation study proved that at both temperatures, A and B, yeasts can be conserved displaying similar viabilities and vitalities. At the end of this study, the yeasts with similar composition revealed good viability and vitality, without variations on the population heterogeneity. Still, the yeast cells proved to be unable to survive on high temperatures, around C temperature, although they have indicated the possibility to survive for short periods of time.

O trabalho apresentado nesta tese realizou-se entre Setembro de 2012 a Outubro de 2013 e teve como objetivo principal a implementação da técnica de citometria de fluxo na Proenol - Indústria Biotecnológica, Ltd. Para a realização deste trabalho recorreu-se à técnica multiparamétrica de citometria de fluxo, para caraterizar células de levedura, e à cinética fermentativa, para monitorizar a evolução das fermentações. A caraterização focou-se nas propriedades fisiológicas das leveduras permitindo um acompanhamento da evolução e heterogeneidade da vitalidade e do estado adaptativo das células de levedura. Os parâmetros monitorizados por citometria de fluxo neste trabalho foram: células viáveis; células metabolicamente ativas; células com membrana íntegra; lípidos neutros e trealose. A levedura utilizada foi Saccharomyces cerevisiae imobilizada numa matriz de alginato de cálcio, identificada comercialmente por ProElif® para produção de espumantes, sendo inoculada diretamente no vinho. Todavia, as esferas de ProElif ® podem ser previamente rehidratadas para casos específicos, como os das paragens das fermentações em garrafas. Com o aparecimento de um nicho de mercado que utiliza o ProElif® para reiniciar fermentações paradas, surgiu o interesse por parte da empresa Proenol em avaliar o efeito da rehidratação sobre a levedura imobilizada ProElif® e, em simultâneo, comparar a inoculação de leveduras com e sem rehidratação em vinho. Outro interesse demonstrado pela empresa e que foi alvo de estudo neste trabalho, prende-se com a conservação das leveduras imobilizadas em condições diferentes das recomendadas pela Proenol. Neste estudo, foi avaliado o impacto de temperaturas superiores às recomendadas e acompanhou-se o estado fisiológico das leveduras durante 4 meses de conservação. Os resultados obtidos neste trabalho demonstraram que a rehidratação é uma etapa importante para melhorar a cinética fermentativa, tendo-se observado um arranque de fermentação mais rápido e uma redução na duração da segunda fermentação. No estudo de conservação, constatou-se que as leveduras poderão ser conservadas tanto à temperatura A como à temperatura B, mantendo viabilidades e vitalidades semelhantes. No fim do ensaio observou-se que as leveduras produzidas com a mesma composição mantêm uma boa viabilidade e vitalidade sem variações da heterogeneidade populacional. As células de leveduras conservadas à temperatura C demonstraram ser incapazes de sobreviver embora tenham indicado a possibilidade de sobrevivência por períodos curtos de tempo.

Mestrado em Biotecnologia - Biotecnologia Industrial e Ambiental