Os queijos de Nisa e Azeitão fazem parte da lista dos queijos portugueses com Denominação de Origem Protegida (DOP). Apesar de serem produzidos em regiões distintas, apresentam algumas semelhanças, tais como a utilização de leite de ovelha cru e o tipo de coalho (Cynara cardunculus). A produção destes queijos conta com a ação de bactérias ácido láticas que estão presentes no processo de fermentação e de maturação, tendo estas contribuições relevantes para as propriedades organoléticas do produto final. Estas bactérias, apesar de apresentarem inúmeras vantagens tecnológicas, podem ser veículos de transmissão de genes, tanto de resistência a antibióticos, como de fatores de virulência. Nesse contexto, esta dissertação teve como objetivo a caracterização microbiana de bactérias ácido láticas, particularmente Enterococcus spp., e a avaliação do seu potencial de patogenicidade. Por fim, a comparação entre os resultados obtidos no presente estudo e os obtidos ao longo dos anos 2016- 18. Durante o ano de 2019 foram recolhidos queijos produzidos em queijarias tradicionais de Azeitão e Nisa. A partir dessas amostras foram isoladas as bactérias ácido láticas, recorrendo a diferentes meios de cultura. De seguida, para a avaliação da diversidade microbiana dos isolados, foi aplicada a técnica de RAPD-PCR. A análise dos perfis obtidos permitiu a construção de dendrogramas e a partir destes foi possível avaliar a semelhança genómica entre os isolados, e consequentemente fazer a escolha dos representantes e calcular índices de diversidade. Os resultados obtidos para os queijos em análise, mostraram que os Lactococcus spp. são o grupo predominante, estando Enterococcus spp. presente em número mais reduzido, apesar da sua elevada diversidade genómica (demonstrada pelo cálculo dos índices de diversidade). Estes resultados foram concordantes com os obtidos em anos transatos. Uma análise mais detalhada dos enterococos, mostrou ser a espécie E. faecalis a predominante nos queijos DOP em estudo, seguida das espécies E. faecium e E. durans. Quanto à resistência a antibióticos, a mesma foi estudada com recurso a técnicas de difusão em disco e PCR-multiplex dirigido a determinantes de resistência. Foram observadas algumas diferenças no número de isolados resistentes ao longo dos anos de estudo. Enterococcus sp. mostraram ser resistentes à grande maioria dos antibióticos estudados e foi ainda identificado um isolado multirresistente. Em relação aos genes de resistência pesquisados, concluímos que 100% dos isolados resistentes à tetraciclina apresentam o gene tet(M), 67% dos isolados resistentes à eritromicina apresentam o gene erm(B) e, por fim, o isolado resistente à vancomicina não apresenta os genes van(A) ou van(B). Relativamente à pesquisa de fatores de virulência, verificou-se que 26% dos isolados apresentavam atividade positiva para a hemólise, uma percentagem bastante superior às obtidas em anos anteriores, 45% dos enterecocos demonstraram resultados positivos para a produção de gelatinase e 40% apresentaram atividade proteolítica. Dos genes de virulência pesquisados, nenhum isolado tinha presente no seu genoma os genes agg e cylA, no entanto o gene esp estava presente em 19% dos isolados e gelE em 26%. Em suma, os resultados deste estudo comprovam que cada queijo analisado possui uma microbiota autóctone característica e relevante para as propriedades do produto final. Relativamente ao seu potencial de patogenicidade, foram identificados isolados resistentes a alguns antibióticos de importância clínica, sendo ainda identificada, capacidade hemolítica e proteolítica. O facto de existir apenas um isolado multirresistente diminui o potencial risco associado.

Nisa and Azeitão Portuguese cheeses are products with Protected Designation of Origin (PDO). Although produced in distinct regions, these cheeses share some similarities, such as raw sheep's milk and the type of rennet (Cynara cardunculus) in their production process. Lactic acid bacteria (LAB) act on the fermentation and maturation stages of the PDO-Cheese production process, significantly influencing the organoleptic properties of the final product. Despite their many technological advantages, these bacteria can also be responsible for the transference of antibiotic resistance genes or virulence factors. In this context, this dissertation aimed to characterize lactic acid bacteria (in particular Enterococcus spp.) and evaluate the underlying pathogenic potential, by performing phenotypic and genotypic analysis of antibiotic resistance and virulence factors. Also, to compare the results of the current study with those obtained between 2016-18. In 2019, cheese samples were colected from traditional producers in Azeitão and Nisa used to isolate lactic acid bacteria using different culture mediums. RAPD-PCR technique was aplied to assess the microbial diversity of the isolates. Then, the profiles obtained were analyzed to create dendrograms. From this analysis it was possible to evaluate the genomic similarity between the isolates, to choose representative isolates, and to calculate diversity indexes. Data analysis for the two types of cheese revealed that Lactococcus spp. is the predominant genera and Enterococcus spp., despite being in a smaller number, shows high genomic diversity. These conclusions are in agreement with the results obtained in previous years (2016-18). Further analysis of the isolated enterococci showed that E. faecalis is the predominant species, followed by E. faecium and E. durans. Regarding the resistance to antibiotics, which was studied using disc diffusion and multiplex PCR techniques, several differences were found in the number of isolates resistant when compared to previous years. Enterococcus spp. showed to be resistant to the majority of antibiotics and a multidrug-resistant isolate was also identified. Regarding the resistance genes investigated, the study concluded that 100% of the tetracycline resistant isolates harbor the tet(M) gene, 67% of the erythromycin-resistant isolates possess erm(B) gene, and, finally, the vancomycin-resistant isolate does not carry the van(A) or van(B) genes. Concerning the search for virulence factors, it was found that 26% of the isolates had a positive activity for hemolysis, a much higher percentage obtained than in previous years, 45% of the isolates showed positive results for the production of gelatinase and 40% showed proteolytic activity. For the virulence genes studied, none of the isolates had agg and cylA genes in its genome, however, the esp gene was present in 19% and gelE in 26% of the isolates. In conclusion, the results of this study have shown that each analyzed cheese has a specific characteristic microbiota, which is relevant to the organoleptic characteristics of the final product. Regarding the pathogenic potential, we identified several isolates that are resistant to a significant number of antibiotics with clinical importance, hemolytic, and proteolytic activity. The fact that there was only one multidrug-resistant isolate decreases the putative risk associated.

Tese de mestrado em Microbiologia Aplicada, Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2020