A hipertensão arterial constitui um dos principais fatores de risco cardiovascular, o que associado à sua elevada prevalência na população portuguesa, é responsável pela elevada morbilidade e mortalidade associadas às doenças cardiovasculares. Deste modo, os fármacos anti-hipertensores (AHTs) representam um importante grupo de substâncias utilizadas para o controlo dos valores de tensão arterial. Ainda assim, a adesão a esta terapêutica farmacológica é reduzida e a maior parte dos doentes medicados apresenta valores acima dos objetivos terapêuticos estabelecidos, o que em ambos os casos pode resultar em complicações e inclusive na morte.Este trabalho teve como objetivo a validação de um método analítico para determinação simultânea de seis AHTs (amlodipina, hidroclorotiazida, indapamida, lercanidipina, nifedipina e telmisartan). A metodologia analítica consistiu na fortificação de amostras de sangue branco (0,5 mL), com adição de padrão interno (zolpidem-d6), seguida de extração em fase sólida (SPE) com recurso a colunas Oasis HLB (Waters). A análise foi feita através da injeção de 10 µL do extrato num sistema LC-MS/MS (Waters), com ionização por electrospray (ESI) em modo positivo para todos os AHTs, com exceção da hidroclorotiazida, e analisador de massa do tipo triplo quadrupolo operando no modo de monotorização de reações múltiplas (MRM). A separação cromatográfica foi efetuada com uma coluna ACQUITY UPLC® HSS T3 (2,1 x 100 mm I.D., 1,8 µm) (Waters), utilizando uma fase móvel composta por acetonitrilo e ácido fórmico a 0,1 %, em gradiente, com um fluxo de 0,5 mL/min. O método foi validado de acordo com o procedimento em vigor no Serviço de Química e Toxicologia Forenses da Delegação do Centro (SQTF-C) do Instituto Nacional de Medicina Legal e Ciências Forenses, I.P. (INMLCF, I.P.). Os parâmetros de validação estudados incluíram: seletividade, linearidade, eficiência da extração, efeito matriz, limites de deteção e quantificação, precisão e exatidão, entre outros. O método demonstrou ser seletivo na determinação dos seis AHTs, obtendo-se também um desempenho linear para a gama de trabalho compreendida entre 5 e 500 ng/mL, considerando um fator de ponderação de 1/x, sempre com um coeficiente de correlação superior a 0,99. Não foi detetado nenhum fenómeno de arrastamento ou efeito matriz relevante. Os limites de deteção e quantificação obtidos são adequados tendo em conta a gama de trabalho estudada. A eficiência da extração foi superior a 40% para todas as substâncias, com exceção do telmisartan. Portanto, o método validado demonstrou ser capaz de detetar, identificar e quantificar simultaneamente os seis AHTs em amostras de sangue por LC-MS/MS. Por fim, de modo a demonstrar a aplicabilidade do método, foram analisadas amostras de 12 casos forenses, sendo que para cada um deles se determinou, sempre que possível, a concentração destas substâncias em sangue periférico e sangue cardíaco, com o objetivo de avaliar as possíveis diferenças entre ambos. Verificou-se que, de facto, existem diferenças nas concentrações determinadas em ambas as matrizes em consequência do fenómeno de redistribuição postmortem, mais evidente em sangue cardíaco, pelo que é recomendado que a quantificação destas substâncias seja realizada em sangue periférico.

Arterial hypertension is one of the major cardiovascular risk factors, which associated with her high prevalence in Portuguese population, is responsible by the high morbidity and mortality associated with cardiovascular diseases. Accordingly, antihypertensive drugs represent an important group of substances used to control arterial tension values. Even so, compliance to this therapy is reduced and the most part of medicated patients present values over the established therapeutic objectives, which in both cases can result in complications, including death.The main objective of this work was the validation of an analytical method for simultaneous determination of six antihypertensives (amlodipine, hydrochlorothiazide, indapamide, lercanidipine, nifedipine and telmisartan). The analytical methodology consisted in spiking blood samples (0.5 mL), with addition of internal standard (zolpidem-d6), followed by solid phase extraction (SPE) with Oasis HLB columns (Waters). The analysis was made through the injection of 10 µL of the extract in a LC-MS/MS system (Waters), with electrospray ionization (ESI) in positive mode, except for hydrochlorothiazide, and triple quadrupole mass analyzer operating under the multiple reaction monitoring mode (MRM). Chromatographic separation was carried out by an ACQUITY UPLC® HSS T3 (2.1×100 µm I.D., 1.8 µm) column (Waters), using a mobile phase constituted by acetonitrile and formic acid 0.1% gradient, at a flow rate of 0.5 mL/min. The method was validated according to the procedure of Laboratory of Forensic Chemistry and Toxicology, Center Delegation of National Institute of Legal Medicine and Forensic Sciences. The validation parameters studied included: selectivity, linearity, extraction efficiency, matrix effect, limits of detection and quantification, precision, bias, between others. The method showed to be selective in determination of six antihypertensives, achieving a linear performance to work range between 5 and 500 ng/ml, considering a weight factor of 1/x, always with a correlation coefficient higher than 0.99. It was not detected carryover or significant matrix effect. The limits of detection and quantification obtained are adequate, taking into account to the working range studied. The extraction efficiency was above 40% for all substances, with the exception of telmisartan. Therefore, the validated method proved to be able to detect, identify and quantify the six antihypertensives simultaneously in blood samples by LC-MS/MS.Finally, in order to demonstrate applicability of the method, samples of 12 forensic cases were analyzed, by determining the concentration of these substances, whenever possible, in peripheral blood and cardiac blood, with the goal to evaluate the possible differences between both. It was observed that its concentration in both matrices were different, which results from postmortem redistribution. The difference was more pronounced in cardiac blood, then it is recommended that quantification of these substances be performed in peripheral blood.

Dissertação de Mestrado em Química Forense apresentada à Faculdade de Ciências e Tecnologia