Nos países desenvolvidos, o diagnóstico de cancro é cada vez mais comum. Numa era em que as atuais terapias no combate ao cancro não são isentas de riscos, uma nova terapia baseada em plasma, o quarto estado da matéria, captou a atenção da comunidade médica. O objetivo deste trabalho foi avaliar o efeito, a seletividade e os mecanismos de ação do plasma frio atmosférico (CAP) numa linha celular humana de retinoblastoma Y79. Desenvolvemos um dispositivo eletrónico capaz de gerar CAP, com ar, 2mm acima de uma suspensão de células Y79, em placas multipoços. O espectro de emissão do plasma (OES) foi obtido por um espectrómetro. Para testar a citotoxicidade e a seletividade do CAP, avaliou-se a atividade metabólica de células Y79 e fibroblastos humanos HFF1 tratados de forma semelhante. O protocolo de deteção de apoptose, a análise do potencial de membrana mitocondrial (MMP) e a microscopia óptica para avaliação da morfologia celular foram usados para esclarecer o tipo de morte celular. A coloração com iodeto de propídio e RNAse foi empregue para estudo do ciclo celular e avaliaram-se os efeitos genotóxicos através do ensaio cometa. As espécies reativas de oxigênio e nitrogênio (RS) e as defesas oxidativas foram quantificadas. Para explorar o efeito do campo elétrico sobre os canais de cálcio dependentes de voltagem, procedeu-se ao bloqueio farmacológico com verapamil. A sobrevivência celular foi avaliada pelo ensaio clonogénico. Finalmente, os efeitos antiangiogénicos foram quantificados pelo ensaio do anel aórtico. Após 60s de tratamento com CAP, a atividade metabólica das células de retinoblastoma sofreu uma redução superior a 50%, principalmente devido à apoptose, sem afetar a viabilidade das células HFF1. A diminuição da sobrevivência celular e a acumulação de células nas fases S e G2/M foram vistas sem terem sido detetadas quebras das cadeias de DNA. O OES revelou vários picos no domínio da radiação ultravioleta (UV). Em relação às RS, a concentração de peróxidos intracelulares e óxido nítrico aumentou, apesar da ausência de ativação das defesas antioxidantes e da falta de sucesso na reversão da citotoxicidade com inibidores das espécies reativas de oxigênio (ROS). De igual forma, o verapamil não conseguiu prevenir a morte celular. Adicionalmente, os efeitos antiangiogénicos máximos foram obtidos com 60s de exposição ao plasma. Estes resultados sugerem que a CAP poderá ser uma terapia seletiva anti-inflamatória com o potencial de atingir células tumorais e estruturas de suporte.

In developed countries, the number of new diagnosed cancers is expected to keep rising. Considering the increased demand for alternatives to hazardous current treatments, a new therapy based on plasma, the fourth state of matter, has recently raised the medical community’s attention. The aim of this work was to evaluate the effect, selectivity and mechanisms of action of cold atmospheric plasma (CAP) in a human retinoblastoma cell line.An electronic device was designed to generate CAP, in open air, 2mm above multiwell plates where Y79 cell cultures were seeded. Plasma emission spectrum was obtained by a spectrometer. In order to evaluate the cytotoxicity and selectivity of CAP, the metabolic activity of similarly treated Y79 and human fibroblasts HFF1 cells was assessed. Apoptosis detection, analysis of mitochondrial membrane potential (MMP) and cell morphology were performed to clarify the type of cell death. Propidium-iodide/RNAse staining solution for cell cycle study was used and genotoxic effects were evaluated by comet assay. Oxygen and nitrogen reactive species (RS) and oxidative defenses were quantified. In order to explore the effect of electric fields in voltage-gated calcium channels, blockade with verapamil was applied. Clonogenic assay screened for survival. Finally, antiangiogenic effects were tested with aortic ring assay.After 60s of CAP treatment, the metabolic activity of retinoblastoma cells decreased more than 50%, mainly due to apoptosis, while HFF1 remain viable. Cell survival was reduced and an accumulation of cells in S and G2/M phases was observed, however, no DNA strand breaks were detected. Plasma emission spectrum revealed several peaks in ultraviolet (UV) domain. Regarding RS, the concentration of intracellular peroxides and nitric oxide was increased, despite no activation of antioxidative defenses and lack of success in reverting cytotoxicity with reactive oxygen species (ROS) inhibitors. Likewise, verapamil failed to protect cells from cell death. Additionally, maximal antiangiogenic effects were obtained with 60s of plasma exposure.These results suggest that CAP might be an anti-inflammatory selective therapy with the potential to target tumor cells and supporting structures.

Trabalho de Projeto do Mestrado Integrado em Medicina apresentado à Faculdade de Medicina