Os medicamentos cardiovasculares estão entre os medicamentos mais vendidos em Portugal, principalmente devido à elevada prevalência de hipertensão arterial e outras doenças cardiovasculares. O consumo inadequado destes medicamentos está associado a um aumento do risco de mortalidade. A deteção deste grupo de medicamentos nas amostras recebidas no Serviço de Química e Toxicologia Forenses do Instituto Nacional de Medicina Legal e Ciências Forenses é frequente, sendo necessário a existência de um método abrangente para aplicar na rotina laboratorial. Para tal foi realizada a validação de um método analítico para determinação e quantificação de 23 medicamentos cardiovasculares (Amlodipina, Atorvastatina, Bisoprolol, Captopril, Carvedilol, Diltiazem, Enalapril, Furosemida, Hidroclorotiazida, Indapamida, Lercanidipina, Lisinopril, Losartan, Lovastatina, Metoprolol, Nifedipina, Perindopril, Propranolol, Pravastatina, Sinvastatina, Telmisartan, Valsartan e Verapamilo).O método consistiu na preparação de amostras de sangue (100 µL) por precipitação proteica seguida da análise por Cromatografia Líquida de Altíssimo Desempenho associada a Espetrometria de Massa Sequencial (UHPLC-MS/MS), usando ionização por Eletrospray (ESI) e um Analisador de Massa Triplo Quadrupolo. Para a cromatografia líquida foi usada uma coluna Acquity UPLC HSS T3 (100 mm x 2,1 mm, 1,8 µm) e duas fases móveis (aquosa e orgânica com metanol) contendo formato de amónia 2 mM e ácido fórmico 0,1%, com um fluxo de 0,4 mL/min e volume de injeção de 5 µL. A validação seguiu as diretrizes da Standard Practices for Method Validation in Forensic Toxicology da American Academy of Forensic Science (AAFS) Standards Board (ASB) através da análise dos parâmetros seguintes: seletividade/especificidade, linearidade, efeito matriz, exatidão e precisão, limiares analíticos, estabilidade e integridade da diluição. O método demonstrou ser seletivo e específico para as substâncias, à exceção do Valsartan e do Verapamilo (com uma interferência). O método demonstrou ser linear dentro das gamas analíticas de cada substância com coeficiente de determinação > 0,99, aplicando o fator de ponderação 1/x. Os valores dos limites analíticos foram adequados, à exceção da Pravastatina cujos valores foram ajustados. O efeito matriz (supressão iónica) foi inferior a 25% à exceção da Atorvastatina para uma gama alta (26%), sem evidência de arrastamento. Os valores da exatidão e precisão foram todos inferiores a 20%. Verificou-se que é possível, se necessário, diluir as amostras biológicas até 10 vezes (1:10, v/v) para todas as substâncias (exatidão e precisão < 20%). A estabilidade foi comprovada até 72 horas, no entanto, verificou-se a perda da mesma em 10 substâncias após 1 semana de congelação dos extratos. Foi também estudada a estabilidade a médio prazo usando um sangue fortificado e quantificado ao longo de 3 meses, onde apenas o Captopril, Diltiazem, Lisinopril, Carvedilol, Nifedipina e Lovastatina demonstraram perda da mesma, verificando-se uma queda abrupta da concentração nas duas primeiras substâncias.Assim, é possível concluir que o método é sensível e eficiente para deteção e quantificação das 23 substâncias em estudo e pode ser aplicado na rotina laboratorial do SQTF do INMLCF, I.P., podendo realizar-se no futuro algumas melhorias.

Cardiovascular drugs are among the most widely sold medicines in Portugal, mainly due to the high prevalence of hypertension and other cardiovascular diseases. The inappropriate consumption of this drugs is associated with the risk of mortality. The detection of this group of drugs in the samples received at the Forensic Chemistry and Toxicology Service of the National Institute of Legal Medicine and Forensic Science, I.P. is frequent, so there is a need for a comprehensive method to apply on the laboratorial routine. For that, an analytical method was validated for the determination and quantification of 23 cardiovascular drugs (Amlodipine, Atorvastatin, Bisoprolol, Captopril, Carvedilol, Diltiazem, Enalapril, Furosemide, Hydrochlorothiazide, Indapamide, Lercanidipine, Lisinopril, Losartan, Lovastatin, Metoprolol, Nifedipine, Perindopril, Propranolol, Pravastatin, Simvastatin, Telmisartan, Valsartan and Verapamil).The method involved preparing blood samples (100 µL) by protein precipitation followed by Ultra High Performance Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry (UHPLC-MS/MS) analysis, using Electrospray Ionization (ESI) and a Triple Quadrupole Mass Analyzer. For liquid chromatography, an Acquity UPLC HSS T3 column (100 mm x 2,1 mm, 1,8 µm) and two mobile phases (aqueous and organic with methanol) containing 2 mM ammonium formate and 0,1% formic acid were used, with a flow rate of 0,4 mL/min and an injection volume of 5 µL. Validation followed the guidelines of the Standard Practices for Method Validation in Forensic Toxicology of the American Academy of Forensic Science (AAFS) Standards Board (ASB) by analyzing the following parameters: selectivity/specificity, linearity, matrix effect, accuracy and precision, analytical limit values, stability and dilution integrity. The method proved to be selective and specific for the substances, except for Valsartan and Verapamil (with one interference). The method proved to be linear within the analytical ranges of each substance with a determination coefficient > 0,99, applying the 1/x weighting factor.The analytical limit values were appropriate, except for Pravastatin whose values were adjusted. The matrix effect (ion suppression) was less than 25% except for Atorvastatin for a high range (26%), with no evidence of carryover. The accuracy and precision values were all less than 20%. It was found that it is possible, if necessary, to dilute biological samples up to 10 times (1:10, v/v) for all substances (accuracy and precision < 20%). Stability was proven up to 72 hours, however, it was lost in 10 substances after 1 week of freezing the extracts. Medium-term stability was also studied using blood fortified and quantified over 3 months, where only Captopril, Diltiazem, Lisinopril, Carvedilol, Nifedipine and Lovastatin showed a loss of stability, with a big drop in concentration in the first two substances.Therefore, it can be concluded that the method is sensitive and efficient for the detection and quantification of the 23 substances under study and can be applied in the laboratory routine of the SQTF of the INMLCF, I.P., although some improvements may be made in the future.

Dissertação de Mestrado em Química Forense apresentada à Faculdade de Ciências e Tecnologia