A Mastocitose Sistêmica (MS) é uma condição rara caracterizada pela proliferação anormal de mastócitos (MC), células do sistema imunitário, que se acumulam na medula óssea. Habitualmente, é uma doença que está associada à presença de mutações no gene KIT, especialmente à mutação p.D816V, levando a uma ativação constitutiva de mastócitos. A Mastocitose Sistêmica apresenta uma heterogeneidade clínica elevada, fazendo com que os sintomas variem significativamente entre os pacientes, desde formas indolentes, com sintomas ligeiros como prurido e lesões cutâneas, até formas mais agressivas que podem resultar em insuficiência ao nível dos órgãos e a um prognóstico mais complicado.Este estudo pretende analisar, ao nível da célula única, o perfil genético de mastócitos aberrantes de doentes com diferentes subtipos de mastocitose sistémica, de forma a correlacioná-los com o comportamento clínico da doença e determinar se a mutação KIT p.D816V está presente em toda a população de mastócitos CD25+, com o intuito de relacionar a sua presença com o transcriptoma individual de cada uma das células. Para isso, foram utilizados nove pacientes com diferentes subtipos de MS, dos quais, sete indolentes [ISM (N=5), SSM (N=1) e BMM (N=1)] e dois avançados [ASM-AHN (N=1) e SSM-AHN (N=1)]. Para a deteção da mutação KIT p.D816V, foram realizados ensaios de PCR digital de Célula Única em mastócitos CD25+ previamente separados. Em simultâneo, para os mesmos pacientes, foi realizada uma análise de Célula Única utilizando o sistema Rhapsody (BDB) para obtenção do perfil transcriptómico destas células. Os resultados obtidos evidenciaram uma elevada heterogeneidade nos valores das células positivas para a mutação KIT p.D816V. Além disso, a viabilidade de mastócitos CD25+, após a separação e análise com a plataforma Rhapsody (BDB), foi bastante reduzida para a maioria os pacientes, sendo que alguns não apresentaram células viáveis após o processamento. Por este motivo, e de forma a aumentar a robustez dos resultados, serão necessários mais ensaios de otimização.

Systemic Mastocytosis (SM) is a rare condition characterized by the abnormal proliferation of mast cells (MCs), which are immune cells that accumulate in the bone marrow. It is commonly associated with mutations in the KIT gene, particularly the p.D816V mutation, leading to constitutive activation of mast cells. Systemic Mastocytosis displays high clinical heterogeneity, with symptoms varying significantly among patients, ranging from indolent forms with mild symptoms like pruritus and skin lesions to more aggressive forms that can result in organ failure and a more complicated prognosis.This study aims to analyse, at the Single-Cell level, the genetic profile of aberrant mast cells from patients with different subtypes of systemic mastocytosis, to correlate them with the clinical behaviour of the disease and to determine whether the KIT p.D816V mutation is present in the entire population of CD25+ mast cells, to link its presence to the individual transcriptome of each cell.For this purpose, nine patients with different SM subtypes were studied, including seven indolent cases [ISM (N=5), SSM (N=1), and BMM (N=1)] and two advanced cases [ASM-AHN (N=1) and SSM-AHN (N=1)]. Detection of the KIT p.D816V mutation was performed using single-cell digital droplet PCR assays on previously isolated CD25+ mast cells. Simultaneously, for the same patients, Single-Cell analysis was conducted using the Rhapsody system (BDB) to obtain the transcriptomic profile of these cells.The results revealed a high heterogeneity in the levels of cells positive for the KIT p.D816V mutation. Additionally, the viability of CD25+ mast cells, after separation and analysis with the Rhapsody platform (BDB), was significantly reduced for most patients, with some showing no viable cells after processing. Therefore, to enhance the robustness of the results, further optimization assays will be necessary.

Dissertação de Mestrado em Genética Clínica Laboratorial apresentada à Faculdade de Medicina