El éxito de las fermentaciones en la industria láctea depende de la aptitud tecnológica de las cepas iniciadoras basada, entre otras características, en la resistencia a condiciones de estrés. El objetivo de esta Tesis Doctoral ha sido identificar mecanismos moleculares desarrollados por Lactococcus lactis como respuesta y resistencia al estrés ocasionado sobre la pared celular que, en último término, sirvan como base para optimizar su papel industrial como cultivo iniciador en quesería. La lactococina 972 (Lcn972), una bacteriocina que no forma poros en la membrana sino que bloquea la síntesis de peptidoglicano en el septo, y exclusivamente en Lactococcus, ha sido utilizada como herramienta para provocar estrés sobre la pared celular. Las líneas de actuación para cumplir el objetivo planteado han sido: a) determinar la contribución a la supervivencia de L. lactis de genes que responden al estrés sobre su pared celular; b) identificar mecanismos de resistencia a Lcn972, y c) estudiar el papel de la proteasa FtsH en el ciclo infectivo del bacteriofago TP712. En primer lugar se generaron mutantes multicopia y no funcionales del gen llmg0169 y del operón llmg2164-2163, regulados por el sistema de dos componentes CesSR, y que presentan el mayor grado de inducción como respuesta a estrés sobre la pared celular. Los mutantes se sometieron a condiciones de estrés tecnológico (acidez, temperatura, sal, liofilización, compuestos antimicrobianos y bacteriófagos), lo que permitió demostrar que estos genes eran necesarios, pero no suficientes, para garantizar la viabilidad de L. lactis en esas condiciones. En el caso del operón llmg2164-2163, se demostró que era, además, un determinante de resistencia a Lcn972. Por otro lado, la caracterización genética y fenotípica de mutantes de L. lactis resistentes a Lcn972 permitió identificar mecanismos implicados en dicha resistencia. Entre ellos destacó la modificación de la composición del peptidoglicano en las cepas resistentes, con un mayor contenido de muropéptidos tripéptido, en detrimento de los que contienen pentapéptido.

Estos mutantes fueron, a su vez, resistentes a otros compuestos antimicrobianos y a la infección por los bacteriófagos c2 y sk1, características deseables en cepas de uso industrial. El análisis genético de los mutantes resistentes a Lcn972 puso de manifiesto una deleción de 22,6 kpb incluyendo, entre otros, genes relacionados con el metabolismo de la maltosa, con la infección del bacteriófago c2 y el sistema de dos componentes F, aunque no se pudo demostrar la implicación directa de ninguno de ellos en la resistencia a Lcn972. También se detectó la activación del gen llmg2447, mediada por la inserción en su promotor de la secuencia de inserción IS981. La sobreexpresión de llmg2447 en L. lactis confirió específicamente resistencia a Lcn972. Por su entorno genético, llmg2447 podría haber formado parte de un sistema ancestral anti-sigma/sigma ECF y haber evolucionado hacia un elemento con función protectora. Por último, se estudió el papel de la proteasa de membrana FtsH, cuyo gen también pertenece al regulón de CesR, en la inducción de profagos como respuesta al daño de la pared celular en L. lactis. Los resultados demostraron que, en ausencia de FtsH, el bacteriófago TP712 no es capaz de propagarse en L. lactis debido a su incapacidad de degradar la pared celular de su hospedador. A esta conclusión se llegó tras descartar experimentalmente la implicación de FtsH en otras fases del ciclo biológico del fago como adsorción, integración como profago, escisión y replicación del ADN fágico, o ensamblaje de las partículas virales. Se demostró que estos viriones eran infectivos, pero permanecían retenidos en el citoplasma tras la inducción del profago en L. lactis ¿ftsH. No se ha podido demostrar su papel en la activación de la holina y se postula su implicación en la regulación de la actividad de la endolisina.

Isolation of Lactococcus lactis mutants simultaneously resistant to the cell wall-active bacteriocin Lcn972, lysozyme, nisin, and bacteriophage c2. http://dx.doi.org/10.1128/AEM.00795-12 . http://hdl.handle.net/10261/81013

The putative lactococcal extracytoplasmic function anti-sigma factor Llmg2447 determines resistance to the cell wall-active bacteriocin Lcn972. http://dx.doi.org/10.1128/AAC.01206-12 . http://hdl.handle.net/10261/81156

Contribution of the CesR-regulated genes llmg0169 and llmg2164-2163 to Lactococcus lactis fitness. http://dx.doi.org/10.1016/j.ijfoodmicro.2009.06.002 . http://hdl.handle.net/10261/51415

Lack of the host membrane protease FtsH hinders release of the Lactococcus lactis bacteriophage TP712. http://dx.doi.org/10.1099/vir.0.057182-0 . http://hdl.handle.net/10261/93382

Cell Wall-active Bacteriocins and Their Applications Beyond Antibiotic Activity. http://dx.doi.org/10.1007/s12602-012-9116-9 . http://hdl.handle.net/10261/80726

Peer Reviewed