La Tomografía Óptica Difusiva de Fluorescencia (FDOT) es una técnica de imagen molecular de reciente creación, que ha atraído fuertemente la atención de la comunidad de investigadores biomédicos “preclínicos”, pues utiliza radiación no ionizante y su coste es muy bajo. La conjunción de estos factores la perfilan como una alternativa posible al paradigma nuclear en la investigación con animales pequeños. Debido a la juventud de la técnica, se plantean numerosos interrogantes que abarcan desde sus áreas de aplicación al discurrir de su desarrollo tecnológico. Es la intención de este trabajo dar respuesta a algunos de ellos. En lo que concierne al desarrollo tecnológico hemos construido un FDOT de geometría de placas paralelas que utiliza un reconstructor optimizado. Posteriormente el sistema ha sido clonado, incluyéndose en el gantry rotatorio de un tomógrafo de rayos X (CT). Usando estos dispositivos hemos querido resolver dos cuestiones técnicas relevantes: la primera relativa al grado de detalle necesario en el modelo matemático de transporte de luz. Este modelo alimenta el algoritmo de reconstrucción y habitualmente se construye suponiendo que los sujetos tienen propiedades ópticas homogéneas, junto con el uso de datos normalizados. Hemos demostrado que esta asunción no es válida en presencia de heterogeneidades de dispersión. La segunda cuestión hace referencia a la geometría del montaje experimental, demostrando que la adquisición en placas paralelas es capaz de proporcionar reconstrucciones de mejor calidad que la adquisición en rotación. En lo referente a las áreas de aplicación, en este documento demostramos la capacidad de la técnica para cuantificar in-vivo la concentración de células T fluorescentes en los ganglios cervicales y en el timo de ratones transgénicos.