Lactosehaltige Nebenströme der Milchverarbeitungsindustrie wie Molke und Magermilch-Ultrafiltrationspermeat (MM-UF-Permeat) sind in großen Mengen verfügbare Rohstoffe, die unzureichend verwertet werden. Eine Möglichkeit, diese Nebenströme wertschöpfend zu nutzen, ist die enzymatische Umwandlung von Lactose zu süßeren Monosacchariden. Zu diesen Monosacchariden gehört D-Tagatose, die eine ähnliche Süße und einen etwa 22-fach niedrigeren glykämischen Index als Saccharose hat. Sowohl das Monosaccharidgemisch als auch D-Tagatose könnten als Alternativen zu Saccharose verwendet werden. Zur Herstellung eines solchen Monosaccharidgemisches kann Lactose mittels β-Galactosidase (β-Gal; EC 3.2.1.23) zu D-Glucose und D-Galactose hydrolysiert und D-Galactose mittels L-Arabinoseisomerase (L-AI; EC 5.3.1.4) zu D-Tagatose isomerisiert werden. Diese Isomerisierung wurde bisher in Nebenströmen nur bei pH > 5,0 demonstriert, da die beschriebenen L-AIs bei niedrigeren, für Sauermolke relevanten pH-Werten eine geringe Aktivität und Stabilität aufwiesen. Daher würde eine neu entdeckte L-AI, die bei pH ≤ 5,0 eine hohe Aktivität und Stabilität besitzt, die Produktion von D-Tagatose in diesen Nebenströmen ermöglichen und deren Süße erhöhen. In der ERSTEN STUDIE wurde eine neue L-AI aus Lentilactobacillus parakefiri DSM 10551 (L-AI-Lp) in einem in silico Screening entdeckt und in Escherichia coli in einer Bioreaktorkultivierung produziert (28 µkatGal/LKultur). Die biochemischen Eigenschaften der L-AI-Lp wurden mit denen einer durch Protein-Engineering modifizierten Variante der L-AI aus Geobacillus stearothermophilus (L-AI-N13) verglichen. L-AI-N13 ist in einem Patent von Damhert Nutrition, einem kommerziellen Hersteller von D-Tagatose, beschrieben und wurde in dieser Studie rekombinant produziert sowie vergleichend charakterisiert. Die L-AI-Lp zeigte ihre maximale Aktivität mit CoCl2 bei 75 °C und ≥ 70 % relative Aktivität im pH-Bereich 4–9, wohingegen L-AI-N13 bei pH ≤ 5 keine detektierbare Aktivität aufwies. Zudem isomerisierte L-AI-Lp 45 % von 300 mM D-Galactose in Puffer bei pH 7,5 und 4,5 nach 24 h. Im Unterschied dazu isomerisierte L-AI-N13 D-Galactose nur bei pH 7,5 und erreichte dabei 41 % nach 24 h. In der ZWEITEN STUDIE wurden L-AI-Lp und L-AI-N13 hinsichtlich der Produktion von D-Tagatose in MM-UF-Permeat bei pH 4,5 und 6,5 verglichen. Der Fokus lag dabei auf den Prozessstabilitäten und den Produktausbeuten. Bei 60 °C zeigte die L-AI-Lp eine relative Aktivität von 75 % nach 24 h bei pH 6,5 und 39 % nach 8 h bei pH 4,5. Im Unterschied dazu betrug die relative Aktivität von L-AI-N13 32 % nach 24 h bei pH 6,5, wohingegen bei pH 4,5 keine Aktivität nachweisbar war. Abschließend wurde Lactose (95 g/L) in MM-UF-Permeat bei pH 6,5 mittels L-AI-Lp in Kombination mit kommerzieller β-Gal und Xyloseisomerase (EC 5.3.1.5) zu D-Glucose, D-Galactose, D-Fructose und D-Tagatose (jeweils 23–24 g/L) umgewandelt. Zudem setzten L-AI-Lp und β-Gal Lactose (100 g/L) unter ähnlichen Bedingungen bei pH 4,5 mit 1 mM CoCl2 zu D-Glucose (46 g/L), D-Galactose (22 g/L) und D-Tagatose (23 g/L) um. D-Glucose wurde unter diesen Bedingungen nicht zu D-Fructose isomerisiert, weil die Xyloseisomerase keine Aktivität zeigte. In dieser Studie wurde erstmals die enzymatische Isomerisierung von D-Galactose zu D-Tagatose in einem Nebenstrom der Milchindustrie bei pH ≤ 5,0 demonstriert. In der DRITTEN STUDIE wurde Bacillus subtilis als Produktionswirt verwendet und der Einfluss verschiedener Promotoren sowie von Kultivierungsparametern (pH und DO) auf die intrazelluläre Produktion von L-AI-Lp untersucht. B. subtilis wird in der Industrie zur Herstellung von Lebensmittelenzymen eingesetzt und besitzt den qualified presumption of safety (QPS)-Status der Europäischen Behörde für Lebensmittelsicherheit. Die höchste L-AI-Aktivität wurde mit dem konstitutiven PAprE-Promotor im asporogenen und surfactin-defizienten Stamm B. subtilis 007 Δsfp ΔsigF erzielt. In einer Bioreaktorkultivierung erreichte dieser Stamm eine L-AI-Aktivität von 89 µkatGal/LKultur bei unkontrolliertem pH und niedrigem gelöstem Sauerstoff (DO ≤ 5 %). Diese L-AI-Aktivität war etwa dreimal höher als die in der ersten Studie beschriebene Aktivität der rekombinanten Produktion in Escherichia coli. Darüber hinaus übertraf B. subtilis die bislang erzielten L-AI-Ausbeuten in Organismen der Ordnung Lactobacillales. Abschließend wurde L-AI-Lp durch Hitzebehandlung und zwei Fällungsschritte partiell gereinigt. Dadurch erhöhte sich die spezifische Aktivität um das Achtfache auf 128 nkatGal/mgProtein bei einer Aktivitätsausbeute von 84 %. Zusammenfassend demonstrierte die dritte Studie erstmals die rekombinante Produktion von L-AI-Lp in einem Organismus mit QPS-Status. Damit ist die Grundlage für die Entwicklung eines industriellen L-AI-Lp-Präparats gegeben. Somit könnten lactosehaltige Nebenströme mit saurem pH-Wert, insbesondere Sauermolke, als zusätzliche Rohstoffe für die D-Tagatose-Produktion erschlossen werden.

Lactose-containing byproducts of the dairy processing industry, such as whey and skim milk ultrafiltration permeate (UF-permeate), are widely available feedstocks that remain underutilized. One valorization strategy is the enzymatic conversion of lactose to sweeter monosaccharides, including D-tagatose, which has a similar sweetness and an approximately 22-fold lower glycemic index than sucrose. The monosaccharide mixture and D-tagatose could be used as alternatives to sucrose. The monosaccharide mixture is produced by hydrolysis of lactose to D-glucose and D-galactose by β-galactosidase (β-gal; EC 3.2.1.23), followed by isomerization of D-galactose to D-tagatose by L-arabinose isomerase (L-AI; EC 5.3.1.4). To date, this isomerization has only been reported in dairy byproducts at pH > 5.0 because the described L-AIs showed low activity and stability at lower pH values, which are relevant to acid whey. Therefore, a novel L-AI with high activity and stability at pH ≤ 5.0 would enable the production of D-tagatose in these dairy byproducts and increase their relative sweetness. In the FIRST STUDY, a novel L-AI from Lentilactobacillus parakefiri DSM 10551 (L-AI-Lp) was identified in an in silico screening. It was then recombinantly produced in Escherichia coli in a bioreactor cultivation, yielding an L-AI activity of 28 μkatGal/LCulture. The biochemical characteristics of L-AI-Lp were compared with those of a protein-engineered variant of L-AI from Geobacillus stearothermophilus (L-AI-N13). This variant is described in a patent owned by Damhert Nutrition, a commercial manufacturer of D-tagatose, and was recombinantly produced and comparatively characterized in this study. The L-AI-Lp showed maximal activity in the presence of CoCl2 at 75 °C and retained ≥ 70% relative activity across pH 4–9, whereas L-AI-N13 exhibited no activity at pH ≤ 5. Furthermore, L-AI-Lp isomerized 45% of 300 mM D-galactose in buffer at pH 7.5 and 4.5 after 24 h. In contrast, L-AI-N13 isomerized D-galactose only at pH 7.5, reaching 41% after 24 h. In the SECOND STUDY, L-AI-Lp and L-AI-N13 were compared for D-tagatose production in skim milk UF-permeate at pH 4.5 and 6.5, focusing on process stability and product yields. At 60 °C, L-AI-Lp retained 75% relative activity after 24 h at pH 6.5 and 39% after 8 h at pH 4.5. In contrast, L-AI-N13 retained 32% relative activity after 24 h at pH 6.5, whereas no activity was detected at pH 4.5. Finally, L-AI-Lp, combined with commercial β-gal and xylose isomerase (EC 5.3.1.5), converted lactose (95 g/L) in skim milk UF-permeate pH 6.5 to D-glucose, D-galactose, D-fructose, and D-tagatose (each 23–24 g/L). Furthermore, L-AI-Lp and β-gal converted lactose (100 g/L) to 46 g/L of D-glucose, 22 g/L of D-galactose, and 23 g/L of D-tagatose under similar conditions at pH 4.5 with 1 mM CoCl2. However, D-glucose was not isomerized to D-fructose as no xylose isomerase activity was detected under these conditions. This study is the first to demonstrate the enzymatic isomerization of D-galactose to D-tagatose in a dairy byproduct at pH ≤ 5.0. In the THIRD STUDY, Bacillus subtilis was used as the production host, and the influences of different promoters and cultivation parameters (pH and DO) on the intracellular production of L-AI-Lp were investigated. B. subtilis is a widely used industrial host for the production of food enzymes and has the qualified presumption of safety (QPS) status as designated by the European Food Safety Authority. The highest L-AI activity was obtained with the constitutive PAprE promoter in the nonsporulating and surfactin-deficient strain B. subtilis 007 ∆sfp ∆sigF. In a bioreactor cultivation, this strain achieved 89 µkatGal/LCulture under uncontrolled pH and low dissolved oxygen (DO ≤ 5%). This L-AI activity is approximately threefold higher than that obtained in the recombinant production in Escherichia coli, as described in the first study. Furthermore, B. subtilis exceeded the L-AI production yields achieved with previously used Lactobacillales hosts. The L-AI-Lp was then partially purified by heat treatment and two precipitation steps. This resulted in an eightfold increase in specific activity to 128 nkatGal/mgProtein and a L-AI yield of 84%. In summary, the third study demonstrated the first recombinant production of L-AI-Lp in an organism with QPS status, providing a basis for the development of an industrial L-AI-Lp preparation. This could enable the use of lactose-containing dairy byproducts with acidic pH, in particular acid whey, as additional feedstocks for D-tagatose production.