Latar Belakang : E. coli sebagai flora normal usus dapat bersifat patogen. Namun dapat dilakukan upaya pencegahan dengan cara menghambat pertumbuhan E.coli semakin beragam. Salah satu upaya pencegahan tersebut adalah dengan konsumsi produk yang mengandung bakteri asam laktat (BAL). Salah satu produk yang mengandung BAL adalah yoghurt. Fungsi BAL lebih efektif jika dikombinasikan dengan prebiotik. Pemilihan tepung Mocaf sebagai prebiotik karena pada saat diproduksi, bahan baku singkong melalui tahap fermentasi oleh bakteri asam laktat yang akan menghasilkan asam-asam organik yang berfungsi sebagai antibakteri. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui pengaruh substitusi tepung Mocaf sebagai prebiotik pada yoghurt terhadap uji hedonik dan daya hambat pertumbuhan Escherichia coli.Metode : Merupakan penelitian eksperimental dengan rancangan acak lengkap satu faktor yaitu variasi substitusi tepung Mocaf pada yoghurt dengan 5 taraf perlakuan yaitu yoghurt tanpa substitusi tepung Mocaf sebagai kontrol dan yoghurt dengan substitusi tepung Mocaf 10%, 20%, 30% dan 40%. Analisis statistik dari daya hambat pertumbuhan bakteri E.coli menggunakan uji Kruskal-wallis sedangkan uji kesukaan menggunakan uji Friedman dengan dilanjutkan uji Wilcoxon.Hasil : Diameter zona bening sebagai parameter daya hambat pertumbuhan bakteri paling tinggi pada yoghurt dengan substitusi tepung Mocaf 40% yaitu 2,85 mm. Substitusi tepung Mocaf tidak berpengaruh secara signifikan terhadap aroma, tekstur, warna, dan rasa yoghurt.Simpulan : Yoghurt dengan substitusi tepung Mocaf 40% memiliki daya hambat pertumbuhan bakteri E.coli paling tinggi. Kata kunci : Mocaf; daya hambat pertumbuhan; E.coli; uji hedonik; yoghurt