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Staphylococcus aureus es un patógeno asociado con infecciones intrahospitalarias comúnmente hallado en las fosas nasales y las manos del personal de salud; así como, en superficies ambientales, las cuales se convierten en potenciales reservorios y vehículos de transmisión de infecciones. En este estudio se analizó la frecuencia y la susceptibilidad a penicilina y meticilina de aislamientos ambientales de S. aureus en un hospital de Cuenca. Se recolectaron 50 muestras (30 de dos quirófanos y 20 de la sala de cuidados intensivos). S. aureus se identificó por pruebas fenotípicas y detección molecular del gen nuc. La susceptibilidad a meticilina y penicilina se determinó por el método de difusión del disco en agar y los genes blaZ y mecA por reacción en cadena de la polimerasa. La frecuencia de S. aureus fue de 6% (3/50 cepas). La resistencia a penicilina y meticilina fue de 66,6% (2/3 cepas). Los genes blaZ y mecA se detectaron en las dos cepas resistentes a penicilina y meticilina. La baja frecuencia de S. aureus puede estar relacionada con los ambientes analizados; ya que, las superficies muestreadas son áreas donde se hace énfasis en la aplicación de protocolos de higiene y desinfección para asegurar una adecuada descontaminación.