Le transport du calcium vers l'espace extracellulaire effectué par les pompes Ca(2+) à membrane plasmique (PMCA) est essentiel pour maintenir de faibles concentrations de Ca(2+) dans le cytosol des cellules eucaryotes. L'activité des PMCA est contrôlée par l'auto-inhibition. L'auto-inhibition est soulagée par la liaison de Ca(2+)-calmoduline à la séquence auto-inhibitrice de liaison à la calmoduline, qui, dans le PMCA humain, est située dans le segment C-terminal et entraîne un PMCA de vitesse de transport maximale élevée et d'affinité élevée pour Ca(2+). L'auto-inhibition implique l'interaction intramoléculaire entre le domaine auto-inhibiteur et une région non bien définie de la molécule à proximité du site catalytique. Nous montrons ici que la fusion de la GFP à la terminaison C du PMCA h4xb provoque une perte partielle de l'auto-inhibition en augmentant spécifiquement le Vmax. La mutation du résidu Glu(99) en Lys dans la partie cytosolique de l'hélice transmembranaire M1 à l'autre extrémité de la molécule a rapproché la Vmax de la PMCA h4xb de celle de l'enzyme activée par la calmoduline sans augmenter l'affinité apparente pour le Ca(2+). Au total, les résultats suggèrent que l'interaction auto-inhibitrice du segment C-terminal extrême du PMCA h4 est perturbée par des changements de résidus chargés négativement de la région N-terminale. Cela serait cohérent avec un modèle récemment proposé d'une forme auto-inhibée de la pompe ACA8 de l'usine, bien que certaines différences soient notées.

El transporte de calcio al espacio extracelular llevado a cabo por las bombas de Ca(2+) de membrana plasmática (PMCA) es esencial para mantener bajas las concentraciones de Ca(2+) en el citosol de las células eucariotas. La actividad de las PMCA se controla mediante autoinhibición. La autoinhibición se alivia mediante la unión de Ca(2+)-calmodulina a la secuencia autoinhibidora de unión a calmodulina, que en la PMCA humana se encuentra en el segmento C-terminal y da como resultado una PMCA de alta velocidad máxima de transporte y alta afinidad por Ca(2+). La autoinhibición implica la interacción intramolecular entre el dominio autoinhibidor y una región no bien definida de la molécula cerca del sitio catalítico. Aquí mostramos que la fusión de GFP al extremo C de la PMCA h4xb causa una pérdida parcial de la autoinhibición al aumentar específicamente la Vmáx. La mutación del residuo Glu(99) a Lys en la porción citosólica de la hélice transmembrana M1 en el otro extremo de la molécula acercó la Vmáx de la PMCA h4xb a la de la enzima activada por calmodulina sin aumentar la afinidad aparente por Ca(2+). En conjunto, los resultados sugieren que la interacción autoinhibidora del segmento extremo C-terminal de la PMCA h4 se ve perturbada por los cambios de los residuos cargados negativamente de la región N-terminal. Esto sería consistente con un modelo propuesto recientemente de una forma autoinhibida de la bomba ACA8 de la planta, aunque se observan algunas diferencias.

The transport of calcium to the extracellular space carried out by plasma membrane Ca(2+) pumps (PMCAs) is essential for maintaining low Ca(2+) concentrations in the cytosol of eukaryotic cells. The activity of PMCAs is controlled by autoinhibition. Autoinhibition is relieved by the binding of Ca(2+)-calmodulin to the calmodulin-binding autoinhibitory sequence, which in the human PMCA is located in the C-terminal segment and results in a PMCA of high maximal velocity of transport and high affinity for Ca(2+). Autoinhibition involves the intramolecular interaction between the autoinhibitory domain and a not well defined region of the molecule near the catalytic site. Here we show that the fusion of GFP to the C terminus of the h4xb PMCA causes partial loss of autoinhibition by specifically increasing the Vmax. Mutation of residue Glu(99) to Lys in the cytosolic portion of the M1 transmembrane helix at the other end of the molecule brought the Vmax of the h4xb PMCA to near that of the calmodulin-activated enzyme without increasing the apparent affinity for Ca(2+). Altogether, the results suggest that the autoinhibitory interaction of the extreme C-terminal segment of the h4 PMCA is disturbed by changes of negatively charged residues of the N-terminal region. This would be consistent with a recently proposed model of an autoinhibited form of the plant ACA8 pump, although some differences are noted.

يعد نقل الكالسيوم إلى الفضاء خارج الخلية الذي تقوم به مضخات الغشاء البلازمي Ca(2+) (PMCAs) ضروريًا للحفاظ على تركيزات منخفضة من Ca(2+) في الخلايا الخلوية للخلايا حقيقية النواة. يتم التحكم في نشاط PMCAs عن طريق التثبيط التلقائي. يتم تخفيف التثبيط التلقائي عن طريق ربط Ca(2+) - calmodulin بالتسلسل المثبط الذاتي المرتبط بالكاليمودولين، والذي يقع في PMCA البشري في الجزء الطرفي C وينتج عنه PMCA بسرعة قصوى عالية للنقل وألفة عالية لـ Ca(2+). يتضمن التثبيط الذاتي التفاعل داخل الجزيء بين مجال التثبيط الذاتي ومنطقة غير محددة جيدًا من الجزيء بالقرب من الموقع الحفاز. هنا نظهر أن اندماج GFP إلى الطرف C من h4xb PMCA يسبب فقدانًا جزئيًا للتثبيط التلقائي عن طريق زيادة Vmax على وجه التحديد. جلبت طفرة بقايا Glu(99) إلى Lys في الجزء الخلوي من اللولب الغشائي M1 في الطرف الآخر من الجزيء Vmax من h4xb PMCA إلى قرب ذلك من الإنزيم المنشط بالكاليمودولين دون زيادة التقارب الظاهر لـ Ca(2+). إجمالاً، تشير النتائج إلى أن التفاعل المثبط ذاتيًا لقطاع الطرف C المتطرف من H4 PMCA ينزعج من تغيرات المخلفات السالبة الشحنة في منطقة الطرف N. سيكون هذا متسقًا مع نموذج مقترح مؤخرًا لشكل مثبط ذاتيًا لمضخة ACA8 للمصنع، على الرغم من ملاحظة بعض الاختلافات.