La fusariosi della spiga (Fusarium Head Blight o FHB) è una delle più importanti malattie dei cereali. È causata da varie specie fungine, tra cui F. graminearum e F. avenaceum, che riducono la resa e contaminano le cariossidi con micotossine, come tricoteceni ed enniatine. I cereali pigmentati sono ricchi di antociani (composti fenolici) nel pericarpo (genotipi a pericarpo viola) o nell'aleurone (genotipi ad aleurone blu). È noto che diversi polifenoli svolgono un ruolo nel contrastare lo stress abiotico e biotico delle piante e nel ridurre l’accumulo di micotossine. L’attività di ricerca triennale è stata strutturata in quattro parti principali. Lo scopo della prima parte è stato quello di studiare, attraverso test in vitro, la diretta attività antimicrobica e antimicotossigena di quattro composti antocianici (cianidina, delfinidina, cianidina 3-O-glucoside o C3G e delfinidina 3-O-glucoside o D3G) utilizzando come modello F. avenaceum. I risultati hanno evidenziato come i composti testati portino ad una riduzione della produzione di enniatine dal 20-30% (cianidina e D3G) al 60-80% (delfinidina e C3G). In particolare, il C3G ha un effetto dose-dipendente: aumentando la concentrazione si ottiene un aumento della biomassa e una riduzione delle enniatine prodotte. Attraverso l’analisi dell’espressione genica differenziale, è stato evidenziato come la delfinidina agisca riducendo l’espressione di geni chiave per la produzione delle enniatine (ESYN e KIVR), mentre il trattamento con C3G non ha comportato alcuna differenza di espressione dei geni considerati, suggerendo un’azione a livello post-trascrizionale. Inoltre, è stata inclusa l'analisi dell’espressione di geni legati allo stress ossidativo ed è stato considerato l'effetto combinato di C3G e acido ferulico, l'acido fenolico più abbondante nel frumento. Nella seconda e terza parte, sono stati condotti test di infezione artificiale con F. graminearum in tre genotipi di frumento duro: Svevo (sensibile a FHB), DBC-480 (resistente a FHB) e Purple durum (pericarpo viola con suscettibilità sconosciuta). Questi genotipi sono stati inoculati artificialmente con spore di F. graminearum, al fine di valutare l'interazione genotipo × infezione sui parametri che descrivono i caratteri di produzione, i caratteri correlati ai metaboliti, i caratteri fisiologici e correlarli con parametri associati alla malattia e parametri morfologici della pianta associati alla resistenza alla fusariosi. L'infezione ha influenzato la differenza tra la temperatura della spiga e la temperatura della foglia a bandiera nel controllo resistente e su quello suscettibile in modo opposto, mentre il contenuto totale di antociani (TAC) delle spighe mature è stato notevolmente più basso in Purple durum sottoposto all'infezione rispetto a quello nelle piante sane, mentre la TAC è aumentata nel genotipo resistente infetto, suggerendo un coinvolgimento dei flavonoidi nel meccanismo di resistenza di DBC-480. Nelle tre varietà sopra citate è stata inoltre studiata approfonditamente la via biosintetica dei polifenoli in una fase precoce (2 days post infection, DPI) ed in una fase tardiva (21 DPI) dell'infezione, analizzando l'espressione di geni chiave e la quantificazione dei principali metaboliti. Mentre nella fase iniziale si è verificata una maggiore attivazione dell'intera via nel genotipo resistente DBC-480, nella fase tardiva si è verificata una sovraespressione della fenil-alanina ammoniaca liasi (PAL) e della cinnamato-4-idrossilasi (C4H ) in Svevo, e dei geni che codificano per la calcone sintasi (CHS) e il “purple pericarp MYB 1” (Ppm1) in Purple durum. Quest'ultimo gene codifica un fattore di trascrizione essenziale per la colorazione viola della cariosside e la sua attivazione è stata confermata da una maggiore quantità di antociani accumulati in fase tardiva da Purple durum in risposta all'infezione, in particolare malvidina 3-O-glucoside. Nella quarta ed ultima parte, è stata caratterizzata la resistenza/suscettibilità di 5 genotipi pigmentati di frumento tenero: 3 varietà porpora (Vanilnoir, Indigo e Rosso) e 2 blu (Skorpion e Purendo), confrontate con un controllo suscettibile (Rebelde) e uno resistente (Sumai3). I risultati indicano che Vanilnoir è resistente mentre Rosso è molto suscettibile, pertanto sono stati scelti per la successiva analisi trascrittomica. Vanilnoir ha mostrato una resistenza di tipo II, molto probabilmente grazie al rinforzo della parete cellulare, supportato dalla sovraregolazione dei pathway e delle funzioni legate all’accumulo di lignina e delle ammidi degli acidi idrossicinnamici. I genotipi sensibili hanno mostrato un trade-off crescita-difesa sbilanciato verso la crescita, stimolato dalla sovraregolazione della via biosintetica delle citochinine. È interessante notare che la biosintesi dei flavonoidi è stata potenziata nei genotipi resistenti rispetto a quelli suscettibili, ma nei genotipi pigmentati è stata più stimolata dall'infezione che nelle linee non pigmentate. Più nel dettaglio, mentre in Sumai3 e Rosso la produzione di flavan-3-oli è stata favorita a scapito degli antociani, in Vanilnoir infetto è stata stimolata la produzione simultanea di antociani e flavoni, entrambi potenzialmente coinvolti nel suo meccanismo di resistenza. Inoltre, dieci proteine chinasi recettoriali LRR (LRR-RLKs) sono state sovraregolate esclusivamente nei genotipi resistenti a FHB insieme a due geni della segnalazione MAPK. Ulteriori indagini su questi geni possono fornire preziose informazioni sulla specifica comunicazione tra frumento e F. graminearum.

Fusarium Head Blight (FHB) is one of the most important diseases of cereals. It is caused by various fungal species, including F. graminearum and F. avenaceum, which reduce yield and contaminate grains with mycotoxins, such as trichothecenes and enniatins. Pigmented cereals are rich in anthocyanins (phenolic compounds) in the pericarp layer (purple pericarp genotypes) or in the aleurone layer (blue aleurone genotypes). It is known that various polyphenols play a role in counteracting abiotic and biotic stress in plants and in reducing the accumulation of mycotoxins. The three-year research activity was structured into four main parts. The aim of the first part was to study, through in vitro tests, the antimicrobial and anti-mycotoxigenic activity of four anthocyanin compounds (cyanidin, delphinidin, cyanidin 3-O-glucoside or C3G, and delphinidin 3-O-glucoside or D3G) using as a model F. avenaceum. The results highlighted how the tested compounds lead to a reduction in the production of enniatins from 20-30% (cyanidin and D3G) to 60-80% (delphinidin and C3G). In particular, C3G has a dose-dependent effect: increasing the concentration leads to an increase in biomass and a reduction in enniatins produced. Through differential gene expression analysis, it was highlighted how delphinidin acts by reducing the expression of key genes for the production of enniatins (ESYN and KIVR) and related to the response to oxidative stress, while treatment with C3G did not result in any difference in expression of the genes considered, suggesting an action at the post-transcriptional level. Additionally, expression of genes related to oxidative stress was also included and the combined effect of C3G and ferulic acid, the most prominent phenolic acid in wheat, were considered. In the second and third part, artificial infection tests with F. graminearum were carried out in three durum wheat genotypes: Svevo (susceptible to FHB), DBC-480 (resistant to FHB) and Purple durum (purple pericarp with unknown susceptibility). These genotypes were artificially inoculated with F. graminearum spores, in order to evaluate the genotype × infection interaction on parameters describing production traits, metabolite-related traits, and physiological-related traits and correlated them with disease-associated parameters and FHB resistance-associated plant morphological features. The infection affected the difference between the spike temperature and the flag leaf temperature in the resistant and the susceptible control in an opposite way, while the total anthocyanin content (TAC) of the mature spikes was considerably lower in Purple durum subjected to the infection compared to the mock plants, while TAC increased in the infected resistant genotype, suggesting an involvement of flavonoids in the resistance mechanism of DBC-480. The polyphenol biosynthetic pathway was also studied in depth in the three varieties mentioned above in an early phase (2 day post infection, DPI) and a late phase (21 DPI) of the infection, analyzing the expression of key genes and the quantification of the main metabolites. While in the early phase there is a greater activation of the entire pathway in the DBC-480 resistant genotype, in the late phase there is an over-expression of the phenyl-alanine ammonia lyase (PAL) and cinnamate-4-hydroxylase (C4H) genes in Svevo, and the genes encoding chalcone synthase (CHS) and “purple pericarp MYB 1” (Ppm1) in Purple durum. This last gene encodes a transcription factor essential for the purple coloration of the grains and its activation is confirmed by a greater quantity of anthocyanins accumulated in the late phase by Purple durum in response to the infection, in particular malvidin 3-O-glucoside (oenin). In the fourth and last part, the resistance/susceptibility of 5 pigmented genotypes of common wheat was characterized: 3 purple (Vanilnoir, Indigo and Rosso) and 2 blue varieties (Skorpion and Purendo), compared with a susceptible control (Rebelde) and a resistant one (Sumai 3). From the results, Vanilnoir is resistant and Rosso is very susceptible, therefore they are chosen for subsequent transcriptomic analysis. Vanilnoir showed type II resistance, most likely thanks to the reinforcement of cell wall, supported by the upregulation of pathways and function related to the accumulation of lignin and hydroxycinnamic acid amides. The susceptible genotypes showed a growth–defense trade-off unbalanced towards growth, stimulated by the upregulation of cytokines biosynthetic pathway. Noteworthy, flavonoids biosynthesis was boosted in the resistant genotypes compared to the susceptible ones, but in the purple pigmented genotypes it was more stimulated by the infection than in the yellow pigmented lines. More in detail, while in Sumai3 and Rosso the production of flavan-3-ols was favored to the detriment of anthocyanins, in infected Vanilnoir the simultaneous production of anthocyanins and flavones was stimulated, both potentially involved in its resistance mechanism. Furthermore, ten LRR receptor-like protein kinases (LRR-RLKs) were exclusively up-regulated in the FHB-resistant genotypes together with two genes from the MAPK signaling. Further investigation on these genes can provide valuable information about the specific cross-talk between wheat and F. graminearum.

Dottorato in Scienze delle Produzioni Vegetali e Animali