Ökaryotik hücresel süreçlerin doğru çalışabilmesi için kromatin yapısının dinamik ve esnek olması gerekir. Histon varyantlarının kromatine dahil edilmesi, kromatine yeni yapısal ve işlevsel özellikler kazandırarak, epigenetik esnekliği arttırır. Histon varyantları, transkripsiyon veya hücre bölünmesi gibi birçok hücresel fonksiyonların gerçekleştirilmesinde rol alır ve deregülasyonlarının kanserleşmede sürecinde etkisi vardır. H3.3 proteini, replikasyona-bağımlı eşdeğerlerinden sadece birkaç amino asit farklılık gösteren evrimsel olarak iyi korunmuş bir histon varyantıdır. H3.3 fonksiyonunu belirlemek amacıyla, yeni koşullu nakavt (knock-in/ conditional knock-out) fare modelleri oluşturulmuş ve tanımlanmıştır. Bu modellerde, H3.3'ü kodlayan iki genden biri, H3f3a veya H3f3b, N-terminal etiketli H3.3A veya H3.3B kodlamak üzere modifiye edilmiştir. Ayrıca cre rekombinaz ifadesiyle bu genlerin nakavt edilebilmektedir. Bu çalışmada, karaciğerde, nükleozom çözünürlüğünde, genom çapında FH-H3.3A ve FH-H3.3B yerleşme haritalaması gerçekleştirilmiştir. Bu analiz, H3.3A ve H3.3B'nin promotör bölgelerde benzer şekilde yoğunlaştıklarını ve yoğunluklarının, yüksek gen ekspresyonu ve gen boyunca yoğunlaşma ile pozitif korelasyonda olduğunu göstermiştir. H3.3'ün, ayrıca telomerlerde ve bazı tekrarlayan DNA dizilerinde yoğunlaştığı bulunmuştur. Bazı tekrarlayan bölgelerde H3.3A ve H3.3B, farklı şekilde yoğunlaşmıştır. İki H3.3 geninin de yok edildiği fare elde etme çalışmaları ölümcül sonuçlandığı için, FH-H3.3 farelerinden embriyonik fare fibroblastları (MEF) izole edilmiş ve ölümsüzleştirilmiştir. Cre aracılı nakavt ve RNA enterferans teknolojileri birlikte kullanılarak, H3.3 ifadesinin esas olarak susturulduğu yeni bir hücre modeli geliştirilmiştir. Genom boyunca yoğunlaşma profillerinin H3.3'ün aktif transkripsiyonda bir rolü olduğunu göstermesine rağmen, H3.3 nakavt modelleri üzerine yapılan transkriptom analizleri sonucu çok az sayıda gen etkilenmiştir. İlginç şekilde, H3.3 ifadesi susturulmuş MEF'lerde, mitotik defektler ve anormal nükleer yapılarında yüksek bir artış gözlenmiştir. Böylece, H3.3'ün, mitotik ilerleme sırasındaki genom bütünlüğünün korunmasında önemli ama çoğu zaman az üzerinde durulan bir rol üstlendiği vurgulanmıştır.

Chromatin structure needs to be dynamic and flexible in order for the eukaryotic cellular processes to function correctly. Incorporation of histone variants into chromatin serves to increase epigenetic plasticity by conferring new structural and functional properties to chromatin. Histone variants are implicated in many cellular processes such as transcription or cell division and their deregulation is involved in tumorigenesis. H3.3 is an evolutionarily well conserved histone variant that differs by only a few amino-acids from its replication-dependent counterparts. With the aim of determining H3.3 function, novel knock-in/conditional knock-out mouse models were established and characterized. In these models, one of the two genes coding for H3.3, H3f3a or H3f3b has been modified to code for an N-terminal FLAG-FLAG-HA tagged H3.3A or H3.3B which can be depleted upon Cre expression. Nucleosome resolution genome-wide mapping FH-H3.3A and FH-H3.3B determined that H3.3A and H3.3B were similarly enriched at promoter regions and their enrichment levels positively correlated with high expression and gene body enrichment. They were also found enriched in telomeres and some repetitive DNA sequences. In a subset of these repetitive regions H3.3A and H3.3B showed differential enrichment properties. As double H3.3-KO mouse generation resulted lethal, mouse embryonic fibroblasts (MEFs) were isolated from FH-H3.3 mice and transformed. Using a combination of Cre recombinase mediated knock-out and RNA interference technology, a new cellular model was established where H3.3 expression was essentially depleted. Although H3.3 enrichment profiles were indicative of a role in active transcription, whole transcriptome analysis upon single H3.3 depletion in livers and an almost complete H3.3 depletion in MEFs yielded very few differentially regulated genes. Interestingly, H3.3 depleted MEFs showed a high increase in mitotic defects and abnormal nuclear structures. Thus, an important yet often understudied role for H3.3 in genomic maintenance during mitotic progression was highlighted.

188