ÖZET Günümüzde, immobilize enzimlerin terapide kullanımlarında pek çok sorunla karşılaşılır. Bu sorunların başında taşınım, immunojenik özellik, enzimin kullanılabilirliği gelir. Biyoteknolojinin gelişimi ile birlikte immobilize enzimlerin hazırlanması ve terapide kullanım olanaklarının araştırılmasına ve ortaya çıkan sorunların aşılmasına yönelik çalışmaların oranı gün geçtikçe artmaktadır. Yapılan pekçok çalışmada, immobilize enzim, vücut dışı kan sirkülasyonu ya da ağız yoluyla alım amacıyla kullanılmaktadır. Immobilize enzimler için diğer bir kullanım yolu da parental enjeksiyondur. Bu amaçla in vivo kullanım için çözünür immobilize enzim hazırlanması çalışmanın esasını oluşturur. Ayrıca seçilecek taşıyıcının immunojenik olmaması ve proteinin immobilizasyondan sonra immunojenik özellik göstermemesi önemlidir. Bu çalışmada, hemodiyaliz makinası kullanılmadan kan üre düzeyini in vivo koşullarda düşürmek için suda çözünür immobilize üreaz türevleri hazırlamak amaçlandı. Bu amaç için, literatür verilerine dayanılarak, genel yapısı CH3(OCH2CH2)nOH (n=150, PEG-5000) olan yüksüz, suda çözünür ve immunojenik olmayan polietilenglikol taşıyıcı olarak seçildi. Üreaz kovalent bağlama ile aktive edilmiş PEG üzerine bağlandı. Immobilizasyon üreaz lizin içeriğinin 1,2,3,6,15 katı aktif-PEG kullanılarak gerçekleştirildi. Seçilen immobilize enzimin ve serbest enzimin fiziksel özellikleri (Optimum pH, optimum T) ve kararlılık testleri (4°C ve oda sıcaklığında depo kararlılıkları, termal kararlılık, 37°C de kararlılık) yapıldı. Ayrıca kinetik parametreler, Km ve Vmax her iki enzim için Lineweaver-Burk diyagramları kullanılarak belirlendi. Çalışmalar boyunca elde edilen bulgular doğrultusunda, yapılan yorumlar ve sonuçlar tartışma kısmında ayrıca ilgili kısımlarda detaylıca tartışıldı. 43

5. SUMMARY There are several problems related to the use of immobilized enzymes for therapy. These problems include immunogenecity, rapid removal.site of action and availability of enzyme. With the advance of biotechnology increasing number of immobilized enzymes can now be made available. Therefore, there is increasing interest to solve the other problems. Most of these immobilized enzymes are used for extracorporeal blood circulation and oral administration. Another approach is the use of immobilized enzymes for parental enjection. A general method for reducing, modifying or eliminating the immunogenicity of normally immunogenic proteins should find many applications in immunology and medicine. The carrier and the immobilized enzyme must exhibit a minimum of allergic and immunogenecity. The aim of our study is to prepare nonimmunogenic urease for in vivo research by using activated-polyethyleneglycol-5000 with the general structure CH3(OCH2CH2)nOH. These nonimmunogenic compounds are linear, uncharged and available in various sizes. In this study, urease was covalently immobilized on activated-PEG 5000 using different molar ratio. Physical characterization and stability tests were determined for free and immobilized urease which has 1:3 molar ratio, urease containing lysin and activated PEG 5000. Also, kinetics parameter, Km and Vmax for both enzymes were examined. Comments; advantages an disadvantages of all findings were discussed in detail pertinant to at the end of each section which were given in result and discussion. 42

41