Introdução: A pré-eclampsia (PE) destaca-se como uma das principais causas de morbidade e mortalidade tanto materna como fetal, se caracteriza por ativação anormal do sistema imune inato e adaptativo. No plasma de gestantes portadoras de PE encontram-se níveis elevados de estruturas moleculares associadas ao estresse e morte celular, denominados padrões moleculares associados ao dano (DAMPs) como, proteína de choque térmico (Hsp70), HMGB1 (high mobility group box 1), Hialurona (HA) e Ácido Úrico, que parecem contribuir diretamente com a patogênese dessa doença. Essas DAMPs ligam-se a receptores presentes em células da imunidade inata, podendo ativar um complexo intracelular denominado inflamassoma, responsável pelo processamento e liberação de IL-1β e IL-18. Essas citocinas são potentes mediadores inflamatórios e importantes na ativação da resposta imune adaptativa, auxiliando a diferenciação de células T em Th17 e Th1, respectivamente. Na PE, a ocorrência de resposta inflamatória sistêmica parece decorrer da deficiência no controle de células T efetoras por células T reguladoras (Treg). Portanto, o balanço entre células Treg e Th17 pode ser crítico para a tolerância ao feto e para a prevenção da doença. Objetivos: O presente trabalho teve como objetivos: Avaliar o estado de ativação, endógena e induzida pelas DAMPs (urato monossódico (MSU), HA e Hsp70), em monócitos, pela identificação da presença do inflamassoma e associação com a produção de citocinas; Avaliar o envolvimento das subpopulações de células T (Th1, Th2, Treg e Th17) pela análise dos fatores de transcrição e pelo padrão de citocinas produzidas por essas células estimuladas com as DAMPs (MSU, HA e Hsp70). Métodos e Resultados: Foram estudadas 20 gestantes portadoras de PE, 20 gestantes normotensas (GN) e 20 mulheres saudáveis não grávidas (MNG). O plasma foi separado e armazenado à -80°C para dosagem das DAMPs (ácido úrico, HA, HMGB1 e Hsp70). Monócitos de sangue periférico foram incubados na presença ou ausência das DAMPs (MSU, HA e Hsp70). O sobrenadante obtido após 18h de cultivo foi aspirado e empregado para dosagem das citocinas TNF-α, IL-1β e IL-18 por ELISA. A presença de inflamassoma nessas células foi avaliada pela quantificação de RNAm de NLRP1, NLRP3, caspase-1, IL-1β, IL-18, TNF-α e HMGB1 por RT-qPCR após 4h de cultura. Os resultados mostraram concentração plasmática elevada de MSU, HA, Hsp70 e HMGB1 e expressão gênica endógena de NLRP1, NLRP3, caspase-1, IL-1β, TNF-α e HMGB1 significativamente maior em gestantes com PE em comparação aos grupos GN e MNG. Em relação à produção endógena de citocinas, IL-1β foi maior no grupo PE em relação aos grupos GN e MNG, enquanto IL-18 e TNF-α estão aumentadas apenas no grupo PE comparado ao grupo GN. O estímulo de monócitos de gestantes pré-eclâmpticas e de mulheres não grávidas com MSU induziu aumento na expressão gênica de NLRP3, caspase-1 e TNF-α em relação à expressão endógena nesses grupos, enquanto esse efeito não foi observado em gestantes normotensas. Quando os monócitos foram estimulados com HA observou-se aumento da expressão de RNAm de NLRP1, NLRP3, caspase-1, IL-1β, TNF-α e HMGB1, enquanto Hsp70 estimulou apenas a expressão de RNAm de TNF-α. A análise das citocinas por ELISA mostrou que monócitos de gestantes com PE produziram níveis endógenos e estimulados com MSU mais elevados de IL-1β, IL-18 e TNF-α em comparação ao grupo GN. Todos os grupos apresentaram aumento de IL-1β após estímulo com HA e aumento de IL-1β e TNF-α quando estimulados com Hsp70. Para estudo das subpopulações de células T as células mononucleares do sangue periférico foram avaliadas pela expressão endógena dos fatores de transcrição para células T-bet (Th1), GATA3 (Th2), RORc (Th17) e Foxp3 (Treg) por citometria de fluxo. Essas células foram cultivadas na ausência ou presença das DAMPs e o sobrenadante foi empregado para determinação das citocinas de perfil Th1 (IFN-γ e TNF-β), Th2 (IL-4), Treg (IL-10 e TGF-β1) e Th17 (IL-17 e IL-22) por ELISA. Os resultados mostraram polarização para perfis inflamatórios Th1/Th17 e diminuição de perfis anti-inflamatórios Th2/Treg em gestantes portadoras de PE associados a níveis endógenos elevados das citocinas inflamatórias TNF-α, IFN-γ, IL-17 e diminuídos de TGF-β e IL-10 quando comparadas com gestantes normotensas. O estímulo das células com MSU induziu aumento de IFN-γ, IL-22 em todos os grupos estudados, enquanto os estímulos com MSU e HA induziram aumento de IL-17 somente no grupo de normotensas. As DAMPs MSU e Hsp70 induziram aumento significativo da produção de TNF-α nos grupos de PE e MNG. Níveis elevados de TGF-β1 foram produzidos por células de gestantes portadoras de PE estimuladas com MSU, HA e Hsp70, enquanto HA e Hsp70 induziram diminuição da produção dessa citocina em gestantes normotensas. Conclusões: A maior expressão gênica endógena de NLRP1, NLRP3, caspase-1, IL-1β, HMGB1 e TNF-α em monócitos de gestantes pré-eclâmpticas confirma o estado de ativação dessas células na PE. Assim como a ativação endógena para perfil Th1/Th17 e expressão elevada de citocinas inflamatórias em gestantes pré-eclampticas demonstra o desbalanço inflamatório presente nessas gestantes. As DAMPs foram capazes de estimular tanto a resposta imune inata como a adaptativa em gestantes pré-eclâmpticas sugerindo que essas alarminas desempenham papel na ativação do sistema imune e na liberação de citocinas inflamatórias participando na patogênese dessa importante síndrome da gestação.

Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP)

Pós-graduação em Biologia Geral e Aplicada - IBB

Processo FAPESP: 2013/00534-5