Nikotinamidadenindinukleotid (NAD) er en hydridbærer involvert i redoksreaksjoner i metabolismen. I tillegg er NAD+ et substrat av enzymer som medierer vitale NAD+-avhengige prosesser, der dinukleotidet spaltes, og frigjør en nikotinamiddel (Nam). Vedlikehold av disse prosessene krever en kontinuerlig påfyll av NAD, som hovedsakelig gjøres av Nam-bergingsveien hos pattedyr. Det hastighetsbegrensende enzymet til denne veien, nikotinamidfosforibosyltransferase (NAMPT), bruker Nam og fosforibosylpyrofosfat (PRPP) som substrater for hvilke affiniteten øker etter NAMPTs autofosforylering på histidin 247 (pHis247) i en aktiv aminosyre. Interessant nok har pattedyret NAMPT en eksepsjonelt høy affinitet for Nam sammenlignet med bakterielle enzymer. Målet med studien var å definere de strukturelle tilpasningene til NAMPT som fører til en så høy affinitet for substratet, samt det strukturelle grunnlaget for reguleringen av Nam-affinitet. Multippel proteinsekvensjustering identifiserte i deuterostom NAMPT forekomsten av en strekning på ti aminosyrer som danner en fleksibel overflateløkke (β1-β2-løkke). Vi undersøkte derfor den mulige innvirkningen av denne løkken på proteinstrukturen, aktiviteten og substrataffiniteten ved å bruke en mutant som mangler disse ti aminosyrene. Sletting av β1-β2-løkken reduserte drastisk affiniteten for Nam mens den generelle strukturen stort sett forble upåvirket. Videre ble et antatt kjernefysisk lokaliseringssignal identifisert i β1-β2-sløyfen. Imidlertid kunne vi ikke bekrefte dets involvering i NAMPT subcellulær lokalisering. For å forstå hvordan pHis247 regulerer Nam-affinitet i NAMPT, sammenlignet vi bindingen av det native substratet og nikotinsyre, som har en langt lavere affinitet, ved røntgenkrystallografi og aktivitetsanalyser. Analysene førte til at vi foreslår at koordineringen av Mg2+ av fosfatgruppen til pHis247 optimaliserer posisjoneringen av PRPP, og dermed favoriserer reaksjonen med pyridinbasen. Det evolusjonære utvalget av Nam-berging av NAMPT hos høyere dyr faller sammen med både en diversifisering av NAD-avhengig signalering og forekomsten av β1-β2-løkken. Denne β1-β2-sløyfen ser ut til å være nødvendig for å møte behovet for svært effektiv Nam-resirkulering, i tillegg til fosforyleringen av His247. Dette arbeidet gir ny innsikt i utviklingen og den katalytiske mekanismen til et viktig NAD-biosyntetisk enzym.