Desde mediados del siglo XX, la producción masiva de plásticos ha generado una crisis ambiental debido a su acumulación en vertederos y ecosistemas naturales. Así, se estima que, de los 8.300 millones de toneladas de plásticos producidos globalmente, aproximadamente el 79% permanece sin gestionarse adecuadamente, y menos del 10% es reciclado de manera efectiva. Esta problemática resalta la necesidad de disponer de alternativas sostenibles para la gestión de plásticos, entre las que los sistemas biológicos ocupan un lugar destacado. Ciertos microorganismos, gracias a enzimas tales como lipasas, cutinasas y ligninasas, han demostrado la capacidad de degradar plásticos convencionales muy recalcitrantes tales como el polietileno. Sin embargo, la eficiencia degradativa está limitada, entre otras cosas, por el restringido espectro enzimático que resulta insuficiente para abordar la complejidad que requiere la degradación de los plásticos. En este contexto, el empleo de consorcios microbianos constituidos por dos o más microorganismos se presenta como una solución innovadora, debido a que la combinación de actividades complementarias, incluyendo un mayor rango de enzimas o una mejorada capacidad colonizadora, permiten abordar la complejidad y diversidad estructural de los plásticos. El objetivo principal de esta Tesis Doctoral fue la bioprospección de microorganismos degradadores de plásticos a partir de diversos entornos ambientales para construir consorcios con alta eficacia degradativa en un amplio espectro de polímeros plásticos. Para la consecución de este objetivo principal, se desarrollaron dos estrategias que permitieron obtener microorganismos degradadores de plásticos, tal y como se recoge en los Capítulos 1 y 2 (Sección VII) de esta memoria de Tesis, que se ensamblaron en diversos consorcios cuya eficacia degradativa fue validada en la última fase experimental expuesta en el Capítulo 3 (Sección VII). Una de las estrategias, basada en un proceso de evolución dirigida, implicó un enriquecimiento selectivo a partir de una muestra de suelo contaminado con plástico como única fuente de carbono Para ello, se utilizó un microcosmos contaminado, consistente en una muestra de suelo agrícola en la que se enterró polietileno lineal de baja densidad (LLDPE), buscando promover una exposición prolongada de los microorganismos del suelo al plástico y ejercer una presión selectiva. A partir de estas muestras se realizaron cultivos de enriquecimiento en medio mínimo con film o polvo (microplástico) de LLDPE como única fuente de carbono. Se realizó un enriquecimiento secuencial efectuando transferencias mensuales a medio de cultivo fresco durante un total de 105 días de incubación, monitoreando la abundancia de bacterias y hongos totales en cada transferencia. Dado que la lignina comparte similitudes de recalcitrancia con el LLDPE, también se evaluó la abundancia de microorganismos ligninolíticos bajo la hipótesis de que podrían desempeñar un papel relevante en la degradación de plásticos convencionales. Este enfoque permitió seleccionar dos consorcios microbianos naturales estables. Los microorganismos de ambos consorcios fueron aislados, identificados molecularmente y se caracterizó su perfil enzimático relacionado con la biodegradación del plástico. El análisis mostró que, a medida que avanzaba el proceso de enriquecimiento, se producía una disminución en la diversidad microbiana. El consorcio seleccionado en LLDPE-polvo fue más efectivo que el correspondiente a cultivos con LLDPE-film, logrando una reducción en el peso de los microplásticos entre 2,5% y 5,5%. Algunos miembros de los consorcios mostraron una amplia gama de actividades enzimáticas relacionadas con la degradación de polímeros plásticos recalcitrantes, destacando las cepas Pseudomonas aeruginosa REBP5 y Pseudomonas alloputida REBP7. Las cepas identificadas como Castellaniella denitrificans REBF6 y Debaryomyces hansenii RELF8 también fueron consideradas relevantes, aunque presentaron un menor espectro enzimático. Otros miembros del consorcio podrían colaborar en la degradación preliminar de aditivos asociados al polímero LLDPE, facilitando el acceso posterior a degradadores más eficientes de la estructura de plástico. Estos resultados se recogen en el Capítulo 1 de esta Memoria. Una segunda estrategia para la obtención de microorganismos degradadores de plásticos, que se aborda en el Capítulo 2, se basó en la bioprospección de microorganismos ligninolíticos asociados al compostaje de residuos vegetales. Este estudio tuvo como objetivo demostrar la idoneidad del compostaje como fuente ideal de microorganismos degradadores de plásticos, así como que el criterio de selección basado en el rastreo de cepas ligninolíticas podía conducir a la obtención de cepas con elevado potencial. Estos aspectos se demostraron diseñando consorcios microbianos artificiales con las cepas seleccionadas cuya eficiencia degradativa se comparó con la de los cultivos puros, así como su versatilidad para la degradación de diversos plásticos. Para ello, se estudió el microbioma del compost el cual mostró funcionalidad degradadora de plásticos, especialmente en el material vegetal de partida y en la fase de enfriamiento. Entre los aislados a partir del material sometido a compostaje se seleccionaron los hongos y bacterias ligninolíticos y se analizó su capacidad para producir enzimas asociadas a la degradación de plásticos, así como para colonizar películas plásticas. Los géneros Bacillus, Pseudomonas, Fusarium, Aspergillus, Scedosporium y Pseudallescheria exhibieron una amplia gama de actividades relacionadas con la biodegradación de plásticos, lo que los convierte en candidatos para el ensamblaje de consorcios. La biodegradación de polietileno mediante cultivos individuales y en consorcio reveló que los consorcios, en particular aquellos que combinan Bacillus subtilis RBM2 con Fusarium oxysporum RHM1, incrementaron la eficiencia de degradación. Las combinaciones bacterianas, como Pseudomonas aeruginosa RBM21 y Bacillus subtilis RBM2, demostraron una capacidad degradativa de amplio espectro, siendo activos frente a varios polímeros. Estos resultados permitieron demostrar la efectividad tanto del tipo de muestra como de la estrategia propuesta para la obtención de candidatos adecuados para su integración en consorcios degradadores de plásticos. En la última fase experimental, que se aborda en el Capítulo 3, se emplearon cepas fúngicas y bacterianas seleccionadas en los estudios anteriormente descritos para ensamblar consorcios y validar su capacidad para degradar diversos plásticos, incluyendo polietileno de baja densidad (LDPE), el LLDPE, el PET y el poliestireno (PS), y establecer la existencia de diferencias degradativas dependiendo de si dichos plásticos eran vírgenes o reciclados. Para ello, se ensamblaron consorcios según su complementariedad enzimática combinando cepas bacterianas y fúngicas, cuya capacidad para degradar tanto plásticos vírgenes como reciclados se evaluó mediante técnicas gravimétricas y espectroscopia infrarroja por transformada de Fourier (FTIR). Los consorcios C2 (formado por Bacillus subtilis RBM2, Fusarium oxysporum RHM1 y Alternaria alternata RHM4) y C4 (Bacillus subtilis RBM2 y Pseudomonas alloputida REBP7) mostraron los mejores resultados, logrando una reducción significativa en el peso de plásticos como LDPE reciclado, LLDPE virgen y PET reciclado. El análisis FTIR confirmó estos hallazgos, evidenciando cambios en la estructura química y los grupos funcionales de los plásticos tratados, lo que reflejó una interacción directa entre los consorcios y el material plástico, facilitando su degradación. De acuerdo con los resultados obtenidos, el uso de estrategias biológicas basadas en el diseño y empleo de consorcios microbianos representa un enfoque prometedor para abordar la problemática de los plásticos convencionales

8903 Doctorado en Biotecnología y Bioprocesos Industriales (RD99/11)

Tesis doctoral