La distinción de diferentes formas o compuestos de bilirrubina se ha basado durante mucho tiempo en algunas particularidades de la diazoreacción que sirve para detectar la presencia del pigmento y para determinarlo cuantativamente por colorimetría. En los últimos lustros han sido introducidas algunas técnicas de análisis cromatográfico que han permitido separar distintas fracciones de bilirrubina, pero se sigue recurriendo a la diazorreacción para caracterizarlas y distinguirlas. En 1913, Hijmans Van den Bergh y Snapper introdujeron la reacción diazoica para la determinación cuantitativa de la bilirrubina en el suero, usando etanol con el fin de eliminar las proteínas y obtener un medio homogéneo, en el que fueran solubles la bilirrubina y el agente acoplante. Unos años más tarde Van den Bergh y Müller descubrieron, accidentalmente, que el alcohol no es necesario para el desarrollo del color cuando la reacción se realiza en la bilis y en ciertos sueros ictéricos, y describieron dos tipos de reacción: la “reacción directa", caracterizada por ocurrir en ausencia de alcohol, inmediatamente antes de los 30 segundos, y alcanzando rápidamente la máxima intensidad, y la "reacción indirecta", en la que el color, en ausencia de alcohol, tarda en aparecer de 2 a 4 minutos o incluso más tiempo y alcanza la intensidad máxima muy lentamente. Investigaciones posteriores condujeron a nuevas subdivisiones, ya que se distinguieron tres subtipos de "reacción directa": la inmediata, la retardada y la bifásica. No obstante, como destaca Witt, la diferenciación entre ellas es muy forzada; en realidad todos los sueros, incluso los que se consideran de reacción indirecta típica, pueden dar, sin necesidad de añadir alcohol, una ligera coloración que se inicia después de media hora, una hora o más tiempo, según los casos, y se intensifica lentamente, alcanzando su máxima intensidad en varias horas, hasta 24 en algunos casos (Katznelson, 1920). Las únicas disoluciones con una reacción verdaderamente negativa son las soluciones coloidales acuosas de bilirrubina pura, que no reaccionan aunque se añada alcohol o cualquier otra sustancia. Como resultado de estas investigaciones y las realizadas más adelante, se han descrito diversos "agentes acoplantes" capaces de acelerar la reacción diazoica y de convertir en “directa" la reacción “indirecta" de ciertos sueros y de las disoluciones puras de bilirrubina. Entre ellos se encuentran los alcoholes y otros disolventes orgánicos (acetona, piridina), ciertos ácidos orgánicos (acético glacial, acetoacético, butírico y cítrico), algunas sales de ácidos débiles (acetato sódico, benzoato sódico, salicilato sódico), los ácidos y las sales biliares, y diversas sustancias como cafeína, urea, acetamina y antipirina. En algunos casos el efecto acelerador o acoplante puede ser atribuido a modificaciones del pH, a acciones físicas facilitadoras de la solubilidad de la bilirrubina o a la formación de compuestos moleculares más fácilmente solubles; pero en otros casos, el mecanismo de acción permanece sin explicar. Además, se han encontrado algunos compuestos (ácido ascórbico, cisteína y glutation) capaces de actuar en forma contraria, inhibiendo la reacción diazoica y se ha comprobado que ciertos iones, aniones y cationes, ejercen también una considerable influencia, generalmente aceleradora, sobre la diazorreacción. (Texto extraído y adaptado de la Tesis)

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