A levedura é um elemento fundamental na produção de bebidas fermentadas, desempenhando um papel crucial na indústria cervejeira, como a SuperBock Group, local onde foi realizado o presente trabalho. Existe uma quantidade específica de levedura que se adiciona dependendo do tipo de cerveja que se quer produzir, assegurando um produto final com as características desejadas. Por isso, a contagem celular e a viabilidade celular são parâmetros essenciais para garantir uma fermentação eficiente do mosto. O objetivo deste trabalho foi validar a contagem celular através de citometria de fluxo, Attune CytPix Flow Citometer, recorrendo aos seus detetores de dispersão de luz, capazes de contar e diferenciar partículas com base na morfologia celular, comparando com os valores da concentração de levedura com o método de referência Z2 Coulter Particle Counter and Size Analyzer. Para a avaliação da viabilidade celular, recorreu-se ao corante de ácidos nucleicos iodeto de propídio (PI), que permite distinguir células viáveis de não viáveis com base na integridade da membrana celular. Os resultados foram comparados com o método tradicional de microscopia ótica utilizando azul de metileno. O Z2 Coulter apresentou valores de contagem 18% superiores para amostras de levedura em sementeira (leveduras duas horas apos o início de fermentação) e 15% para leveduras em stockagem (leveduras recolhidas após fermentação para re-pitching), em relação aos obtidos por citometria de fluxo. Estes valores superiores devem-se à maior especificidade da citometria, que permite excluir da análise partículas que não correspondem a células de levedura. Na análise da viabilidade, registaram-se percentagens de células mortas ligeiramente inferiores na citometria de fluxo em comparação com o método microscópico, sugerindo uma maior sensibilidade do método citométrico. Adicionalmente, o corante acetoximetilo 5-CFDA demonstrou ser um marcador eficaz da atividade metabólica, ao permitir avaliar a vitalidade celular com base na fluorescência emitida pela ação de esterases intracelulares. O presente trabalho permitiu implementar a técnica de citometria de fluxo e adaptar os seus resultados aos parâmetros fabris em vigor para contagem celular. Isto levou a uma uniformização dos resultados obtidos, tendo diminuído a variabilidade dos valores de concentração de leveduras em sementeira e das leveduras em stockagem. Estes resultados levaram a um melhoramento na consistência da qualidade de fermentação devido a redução na variabilidade de células viáveis metabolicamente ativas para semear e confirmação do estado da levedura durante o processo fermentativo.

Yeast is a fundamental element in the production of fermented beverages and plays a crucial role in the brewing industry, such as the SuperBock Group, where this work was carried out. There is a specific amount of yeast that is added depending on the type of beer intended to be produced, ensuring a final product with the desired characteristics. For this reason, cell count and cell viability are essential parameters to ensure efficient fermentation of the wort. The aim of this work was to validate the cell count by flow cytometry, using an Attune CytPix Flow Citometer with light scattering detectors capable of counting and differentiating particles based on cell morphology, comparing it with the yeast concentration values obtained by the reference method, Z2 Coulter Particle Counter and Size Analyzer. To assess cell viability, the nucleic acid dye propidium iodide (PI) was used to distinguish viable from non-viable cells based on the integrity of the cell membrane. The results were compared with the traditional optical microscopy method using methylene blue. The Z2 Coulter showed 18% higher count values for seed yeast samples (yeast sampled two hours after the start of fermentation) and 15% higher count values for stock yeast (yeast sampled after fermentation for re-pitching) than those obtained by flow cytometry. These higher values are due to the greater specificity of cytometry, which allows particles that do not correspond to yeast cells to be excluded from the analysis. In the viability analysis, there were slightly lower percentages of dead cells in flow cytometry compared to the microscopic method, suggesting the greater sensitivity of the cytometric method. In addition, the acetoxymethyl dye 5-CFDA proved to be an effective marker of metabolic activity, making it possible to assess cell vitality based on the fluorescence emitted by the action of intracellular esterases. This work made possible to implement the flow cytometry technique and adapt its results to the factory parameters enforced for cell counting. This led to a standardization of the results obtained, reducing the variability of the concentration values of yeast in sowing and yeast in stock. These results led to an improvement in the consistency of fermentation quality due to a reduction in the variability of metabolically active viable cells for seeding and confirmation of the yeast's status during the fermentation process.

Mestrado em Bioquímica