Os mecanismos celulares e bioquímicos subjacentes à disfunção cardíaca associada ao envelhecimento encontram-se pouco esclarecidos e, menos compreendido é o papel do estilo de vida neste processo. No sentido de avaliar a influência do estilo de vida ao longo da vida na potencial perda de funcionalidade das proteínas cardíacas, em particular do citocromo c, utilizaram-se ratinhos C57BL/6 machos que foram sujeitos a um protocolo experimental para simular o envelhecimento sedentário e activo. Os animais foram depois sacrificados, isolaram-se as mitocôndrias do coração e procedeu-se à análise de vários parâmetros bioquímicos com o intuito de (i) avaliar a funcionalidade da cadeia respiratória mitocondrial, (ii) identificar as proteínas susceptíveis à carbonilação e/ou nitração, (iii) caracterizar as PTMs do citocromo c de coração. Os resultados obtidos sugerem a existência de uma relação entre a perda de funcionalidade mitocondrial associada ao envelhecimento e o aumento do teor de proteínas carboniladas e/ou nitradas. Como proteínas alvo destas modificações pós-traducionais (PTMs) foram identificadas várias subunidades dos complexos da fosforilação oxidativa. Pela sua importância neste sistema metabólico, analisou-se mais exaustivamente a susceptibilidade do citocromo c a PTMs resultantes de processos oxidativos e de que forma o estilo de vida regula este processo. Apesar de se ter verificado um aumento da expressão do citocromo c com o envelhecimento, o número e o tipo de PTMs identificadas por LC-MS/MS não seguiu a mesma tendência. Efectivamente, identificou-se um maior número de PTMs no citocromo c do homogeneizado total dos ratinhos jovens (12 PTMs) do que nos ratinhos velhos. Considerando o efeito do estilo de vida, verificou-se a existência nos animais activos de um maior número de resíduos de aminoácidos modificados (10 PTMs) do que nos sedentários (6 PTMs). Curiosamente, a oxidação da Met65 foi a única modificação oxidativa identificada no citocromo c da fracção mitocondrial, tendo sido observada nos ratinhos velhos sedentários. ABSTRACT: Cellular and biochemical mechanisms underlying the age-related cardiac dysfunction are not fully understood and, even less clarified is the influence of lifestyle in this process. In order to evaluate the role of lifelong lifestyle in the mitochondrial plasticity and in the potential functionality loss of cardiac proteins, in particular cytochrome c, to post-translational modifications (PTMs), C57BL/6 male mice were subjected to an experimental protocol simulating sedentary and active aging. After animal sacrifice, mitochondria from cardiac muscle were isolated and several biochemical parameters were measured (i) to evaluate the mitochondrial respiratory chain functionality, (ii) to identify the susceptible proteins to carbonylation and/or nitration, (iii) to characterize the PTMs of cardiac cytochrome c. The results suggest a link between the age-related decrease in mitochondrial functionality and the higher susceptibility of cardiac muscle proteins to oxidative damage. Indeed, we observed a significant increase in the content of carbonylated and/or nitrated proteins in old mice, being the oxidative phosphorylation subunits the most affected. Given the importance of cytochrome c as the final mobile electron carrier in this metabolic process, its susceptibility to PTMs induced by oxidative stress was characterized more exhaustively. Despite the age-induced upregulation of cytochrome c, the number of oxidative PTMs identified by LC-MS/MS was not increased. Indeed, a higher number of PTMs was identified in citochrome c from young mice total homogenate (12 PTMs) compared to old mice. Regarding the effect of lifestyle, old active mice presented more PTMs (10 PTMs) than their sedentary counterparts (6 PTMs). Interestingly, the Met65 oxidation was the only PTM identified in mitochondrial cytochrome c and only in old sedentary mice.

Mestrado em Métodos Biomoleculares