[ES] La enfermedad de Alzheimer (EA) causa un deterioro progresivo del tejido y la funcionalidad del cerebro, provocando un empeoramiento tanto de las habilidades psicomotrices como de los procesos cognitivos, incluyendo el habla, la memoria y el aprendizaje. La EA es la principal causa de demencia en la sociedad occidental, que se manifiesta con mayor frecuencia y agresividad durante el envejecimiento de los individuos. Por tanto, las previsiones indican un incremento de la incidencia de esta patología en los próximos años, debido al aumento de la esperanza de vida y al progresivo envejecimiento de la población. A día de hoy, la EA es considerada una enfermedad progresiva, irreversible e incurable y no existe una cura efectiva para la misma, debido fundamentalmente a su compleja multifactorialidad. Los tratamientos existentes hasta la fecha están centrados en la sintomatología de la enfermedad. Esta patología no solamente provoca un empeoramiento de la calidad de vida del paciente que la sufre, sino también de su entorno familiar, debido al impacto emocional y económico que representa la enfermedad. A consecuencia de esta problemática actual, desde la comunidad científica se ha promovido la búsqueda de tratamientos efectivos, que puedan hacer frente a enfermedades neurodegenerativas como la EA. En este contexto, los productos naturales de origen vegetal están cobrando una fuerte importancia como fuente de moléculas bioactivas de alto valor farmacológico y/o nutracéutico con potencial neuroprotector. En especial, algunos subproductos de origen agroalimentario han demostrado un gran potencial de revalorización y de generación de productos de alto valor añadido, debido a su contenido en moléculas bioactivas con efectos beneficiosos para la salud. En el presente trabajo de investigación se ha planteado un enfoque multianalítico para estudiar el efecto neuroprotector de diferentes extractos enriquecidos en compuestos bioactivos provenientes de fuentes de origen vegetal. Para ello, se ha hecho uso de procesos de extracción verdes basados en la extracción asistida por ultrasonidos (UAE), o en el uso de fluidos comprimidos como la extracción con líquidos presurizados (PLE) y fluidos supercríticos (SFE), haciendo uso de solventes generalmente reconocidos como seguros (GRAS, del inglés Generally Recognized As Safe). Por otro lado, empleando una batería de ensayos de bioactividad in vitro, se ha evaluado el potencial neuroprotector de los bioactivos extraídos, mediante ensayos de inhibición de las enzimas colinesterasas — acetilcolinesterasa (AChE) y butirilcolinesterasa (BChE) —, así como de la enzima lipooxigenasa (LOX), implicadas en procesos de neurotransmisión colinérgica y en procesos neuroinflamatorios, respectivamente. Además, se ha estudiado la capacidad antioxidante de los extractos obtenidos, mediante ensayos de neutralización de radicales libres (ABTS), y de captación de especies reactivas de oxígeno y nitrógeno (ROS y RNS, respectivamente). En paralelo, se ha caracterizado la composición fitoquímica de los extractos evaluados mediante el uso de técnicas analíticas avanzadas como la cromatografía de gases y la cromatografía líquida acopladas a espectrometría de masas en tándem de alta resolución (GC-Q-TOF MS/MS y LC-Q-TOF MS/MS). Mediante un estudio de bioprospección, se evaluó la capacidad neuroprotectora in vitro de múltiples biomasas vegetales. Los extractos de mayor potencial neuroprotector in vitro fueron los obtenidos con materias primas vegetales procedentes de la industria agroalimentaria como Citrus sinensis PLE100, Cyphomandra betacea T33, Coffea arabica PPC1, Olea europaea L., OL-SS, Robinia pseudoacacia ASFE y Nothofagus pumilio LPLE; de las plantas Rosmarinus officinalis L. RSFE y Kalanchoe daigremontiana KD y el alga Dunaliella salina DS. Entre los resultados principales cabe destacar el alto potencial inhibitorio de los extractos ASFE, DS, KD y PPC1 para enzima AChE; mientras que los extractos ASFE, LPLE, RSFE y KD mostraron una alta capacidad de inhibición de la actividad enzimática BChE. El extracto de ASFE, obtuvo valores cercanos al de la galantamina (usado como control positivo y uno de los tratamientos actuales de la EA). Los extractos seleccionados son considerados de alto potencial antiiflamatorio por su capacidad de inhibición sobre la enzima LOX, y también de alta capacidad antioxidante por los experimentos realizados con los radicales ABTS, ROS, y RNS, especialmente los extractos KD y RSFE. El perfil fitoquímico del extracto PLE100 mostró un enriquecimiento en terpenoides, además de ácidos grasos insaturados y fitoesteroles. En el caso del extracto OL-SS, también se encontró una gran abundancia de múltiples terpenoides, destacando los triterpenos. Los compuestos bioactivos más destacables del extracto DS fueron los carotenoides. De forma global, los compuestos mayoritarios en los extractos T33, PPC1, ASFE, LPLE y KD, fueron los fenólicos, encontrándose una gran diversidad de los mismos. El extracto RSFE fue usado en esta tesis doctoral como control positivo de los ensayos de bioactividad in vitro, dada su contrastada bioactividad en estudios previos, gracias a su alta concentración en compuestos funcionales como terpenos y fenólicos. La capacidad de los compuestos bioactivos de atravesar la barrera hematoencefálica (BHE) para ejercer su función neuroprotectora en el cerebro se evaluó mediante dos metodologías complementarias. En una primera aproximación se usó una metodología in vitro basada en una membrana artificial paralela (PAMPA-BBB) para simular las propiedades fisicoquímicas de la BHE. Posteriormente, se usó un modelo celular más avanzado, basado en células endoteliales microvasculares del cerebro humano (HBMEC-BBB), consideradas la base anatómica y funcional de la BHE. Ambos modelos arrojaron información valiosa sobre las propiedades fisicoquímicas de determinadas moléculas con alta capacidad de perfusión en la BHE. Entre estas propiedades se observó que una polaridad intermedia de los compuestos (logP entre 0 y 2); un área de superficie polar topológica menor (TPSA) a 90 Å2 y un peso molecular (MW) inferior a 500 Da, son propiedades clave en su permeabilidad a través de la BHE. Así, compuestos de menor tamaño como los monoy sesquiterpenos, así como los ácidos fenólicos, mostraron una alta capacidad de atravesar la BHE. Otros compuestos, con características moleculares diferentes también consiguieron atravesar la BHE, probablemente mediados por transportadores celulares incluidos en el modelo HBMEC-BBB. Se evaluó el posible efecto de toxicidad celular de los extractos en cuatro líneas celulares humanas diferentes: células de riñón humano HK-2, monocitos THP-1, células endoteliales HBMEC y neuroblastomas SH-SY5Y. Atendiendo a la citotoxicidad observada, se consideró a los extractos PPC1, OL-SS, T33 y el RSFE no tóxicos; ASFE, DS, PLE100 y el LPLE fueron considerados como extractos de moderada citotoxicidad; mientras que el extracto KD fue altamente citotóxico. Otros ensayos celulares mostraron un efecto neuroprotector del extracto PLE100, resultando proteger al neuroblastoma SH-SY5Y de la muerte celular inducida con ácido L-glutámico. Finalmente, los extractos de mayor efecto neuroprotector in vitro, y que además mostraron resultados favorables en los ensayos de permeabilidad de BHE, fueron seleccionados para probar su efecto neuroprotector en un modelo in vivo de EA, usando la cepa transgénica CL4176 del nematodo Caenorhabditis elegans (C. elegans). Los extractos de PLE100 y DS, usados a una concentración de 50 μg/mL resultaron ser los que ofrecieron un mayor efecto de neuroprotección sobre el modelo in vivo de C. elegans, protegiendo al nematodo de la parálisis inducida por la placa Aβ42. Este extracto ofreció mayor efectividad que el control positivo (un extracto de Ginkgo biloba EGb761). Haciendo uso de diferentes herramientas ómicas se consiguió dilucidar algunos mecanismos por los cuales el extracto PLE100 podría estar ejerciendo un efecto neuroprotector sobre C. elegans. El uso de varias plataformas ómicas como la lipidómica, la transcriptómica y la metabolómica, permitió la identificación y cuantificación de una gran cantidad de metabolitos como lípidos, genes (proteínas asociadas) y aminoácidos, entre otros, revelando algunas rutas metabólicas y procesos celulares alterados como el metabolismo de lípidos. El extracto PLE100 presentó una gran diversiadad de compuestos bioactivos entre los cuales se podrían destacar los ácidos grasos insaturados, terpenos, compuestos fenólicos, carotenoides y fitoesteroles, entre otros. Todos ellos podrían tener un efecto sobre la neuroprotección observada en el modelo in vivo de C. elegans. La capacidad antioxidante del extracto PLE100, junto con la inducción de varios genes relacionados con la respuesta al estrés y mecanismos de respuesta defensiva antioxidante y detoxificante, parecen ser los mecanismos responsables de evitar la parálisis inducida y aumentar la supervivencia del nematodo tratado.

[EN] Alzheimer's disease (AD) causes a progressive deterioration of the brain tissue and its functionality, leading to a worsening of psychomotor skills and cognitive processes, including speech, memory and learning. AD is the leading cause of dementia in Western society, manifesting more frequently and aggressively during the ageing of individuals. Therefore, predictions indicate an increase in the incidence of this pathology in the coming years, due to the increase in life expectancy and the progressive ageing of the population. Nowadays, AD is considered a progressive, irreversible and incurable disease and there is no effective cure for it, mainly due to their complex and multifactorial nature. Existing treatments are focused only on the disease symptoms. This pathology not only causes worsening of the quality of life on the people affected by this illness, but also of their families, due to the emotional and economic impact of the disease. Because of this problematic situation, the scientific community has promoted the seek of an effective treatment for neurodegenerative diseases such as AD. In this context, natural products from plants are gaining importance as a source of bioactive molecules with high pharmacological and/or nutraceutical value and neuroprotective potential. In particular, some by-products from agri-food industry have shown great potential for revalorization and generation of high value-added products, due to their content in bioactive molecules with beneficial effects on health. In the present research work, a multi-analytical approach has been proposed to study the neuroprotective effect of different extracts enriched in bioactive compounds from different plant sources. For this purpose, we employed green extraction processes based on ultrasound-assisted extraction (UAE), or the use of compressed fluids such as pressurized liquid extraction (PLE) and supercritical fluids (SFE), making use of Generally Recognized As Safe (GRAS) solvents. On the other hand, using a battery of in vitro bioactivity assays, the neuroprotective potential of the extracted bioactives has been evaluated through inhibition assays of the cholinesterase enzymes - acetylcholinesterase (AChE) and butyrylcholinesterase (BChE) - as well as of the lipoxygenase enzyme (LOX), involved in cholinergic neurotransmission processes and neuroinflammation, respectively. In addition, the antioxidant capacity of the obtained extracts has been also studied by free radicals (ABTS), and reactive oxygen and nitrogen species (ROS and RNS) scavenging assays. In parallel, the phytochemical composition of the evaluated extracts has been characterized making use of advanced analytical techniques such as gas chromatography and liquid chromatography coupled to high resolution tandem mass spectrometry (GC-Q-TOF MS/MS and LC-Q-TOF MS/MS). Through a bioprospection study, the in vitro neuroprotective capacity of several plant biomasses was assessed. The extracts with the highest in vitro neuroprotective potential were obtained from the agri-food industry raw materials such as Citrus sinensis PLE100, Cyphomandra betacea T33, Coffea arabica PPC1, Olea europaea L. OL-SS, Robinia pseudoacacia ASFE and Nothofagus pumilio LPLE; of the plants Rosmarinus officinalis L. RSFE and Kalanchoe daigremontiana KD and the algae Dunaliella salina DS. The high inhibitory potential of the ASFE, DS, KD and PPC1 extracts for AChE enzyme was remarkable; while ASFE, LPLE, RSFE and KD extracts showed a high inhibitory capacity for BChE enzymatic activity. The ASFE extract obtained values close to the drug galantamine (used as a positive control and one of the current treatments for AD). The abovementioned extracts were shown to have high anti-inflammatory potential due to their satisfactory inhibition capacity on LOX enzyme, and also high antioxidant capacity in the radical scavenging experiments performed with ABTS, ROS, and RNS species, especially in the case of KD and RSFE extracts. The phytochemical profile of the extract PLE100 showed an enrichment of terpenoids, as well as unsaturated fatty acids and phytosterols. In the case of OL-SS extract, a high abundance of multiple terpenoids was also found, especially triterpenes. The most abundant bioactive compounds found in the DS extract were carotenoids. The major bioactive compounds found in the T33, PPC1, ASFE, LPLE and KD extracts were a great diversity phenolics. RSFE was used in this PhD work as a positive control extract for the in vitro bioactivity assays, considering its well-reported bioactivity, due to its high content on functional compounds such as terpenes and phenolics. The ability of the studied bioactive compounds to cross the blood-brain barrier (BBB) to exert their neuroprotective function in the brain was evaluated using two complementary methodologies. In a first approach, an in vitro methodology, based on parallel artificial membrane (PAMPA-BBB) was used to simulate the physicochemical properties of the BBB. Subsequently, a more advanced cellular model based on human brain microvascular endothelial cells (HBMEC-BBB), considered the anatomical and functional basis of the BBB, was used. Both models yielded valuable information about physicochemical properties of molecules with perfusion capacity across the BBB. Among these physicochemical properties, it was observed that an intermediate polarity of the compounds (logP between 0 and 2); a topological polar surface area (TPSA) less than 90 Å2 and a molecular weight (MW) less than 500 Da, are key molecular properties in the permeability through the BBB. Thus small size mono- and sesquiterpenes as well as phenolic acids showed a high ability to cross BBB. Other compounds, with different molecular properties were also able to cross the BBB, probably mediated by cellular transporters in the HBMEC-BBB model. The possible cytotoxic effect of the extracts was evaluated in four different human cell lines: human kidney cells HK-2, THP-1 monocytes, HBMEC endothelial cells and SH-SY5Y neuroblastoma. According to the observed cytotoxicity, the extracts PPC1, OL-SS, T33 and RSFE were considered as no toxic; ASFE, DS, PLE100 and LPLE were considered as extracts with moderate cytotoxicity; while the KD extract presented high toxicity. Other cellular assays showed a neuroprotective effect of the PLE100 extract, protecting SH-SY5Y neuroblastoma from L-glutamic acid-induced cell death. Finally, the extracts with the highest in vitro neuroprotective effect and positive results in BBB permeability assays, were selected to be tested in an in vivo model of AD, using the CL4176 transgenic strain of the nematode Caenorhabditis elegans (C. elegans). The extracts PLE100 and DS, assayed at a concentration of 50 μg/mL, showed a neuroprotective effect on the in vivo model of C. elegans, protecting the nematode from the paralysis induced by the Aβ42 plaque. These extracts were more effective than the positive control used (Ginkgo biloba EGb761extract). Using different omics tools, some mechanisms that explain the neuroprotective effect of PLE100 extract on C. elegans were elucidated. The use of several omic platforms such as lipidomics, transcriptomics and metabolomics, allowed the identification and quantification of a large number of metabolites such as lipids, genes (and their linked proteins) and amino acids, among others, revealing altered metabolic pathways such as lipid metabolism. The PLE100 extract presented a great richness and concentration of bioactive compounds such as unsaturated fatty acids, terpenes, phenolic compounds, carotenoids and phytosterols, among others. All of them seem to have a synergistic effect on the neuroprotection observed in the in vivo model of C. elegans. The antioxidant capacity of the PLE100 extract together with the induction of several genes related to oxidative stress response and antioxidant and detoxifying defensive response, seem to be the mechanisms responsible for avoiding the induced paralysis and increasing the survival of the nematode treated with the PLE100 extract.

Esta Tesis Doctoral se ha realizado gracias a una Ayuda para la Formación de Profesorado Universitario (FPU17/01876), proporcionada por el Ministerio de Universidades. Además de la financiación de los siguientes proyectos, proporcionados por el Ministerio de Ciencia e Innovación: - AGL2017-89417-R “Revalorización, desde una perspectiva de biorrefinería, de terpenos procedentes de algas y subproductos agroalimentarios y evaluación Alimentómica de su actividad frente a Alzheimer”. - PID2020-113050RB-I00 “Procesos bioguiados y sostenibles para explorar el potencial neuroprotector in-vivo de subproductos agroalimentarios y biomasas infrautilizadas”. - PDC2021-120814-I00 “Escalado de un proceso de obtención de extractos neuroprotectores a partir de matrices naturales para su potencial empleo como ingredientes alimentarios”.

Memoria presentada por José David Sánchez Martínez para optar al grado de Doctor en Ciencias de la Alimentación, realizada en el Instituto de Investigación en Ciencias de la Alimentación (CIAL, CSIC-UAM).

Peer reviewed