La diabetes mellitus es una enfermedad de una gran prevalencia entre la población mundial que desencadena una serie de complicaciones crónicas en los pacientes, lo que conduce a un deterioro de su calidad de vida. Entre estas complicaciones, la aterosclerosis y la nefropatía constituyen la principal causa de morbimortalidad y enfermedad renal crónica en los pacientes diabéticos, ya que actualmente no existen alternativas terapéuticas que frenen eficazmente la aparición de eventos cardiovasculares o la progresión a insuficiencia renal. La aterosclerosis y la nefropatía diabética comparten características similares desde el punto de vista de su patogenia, entre ellas la activación de mecanismos inflamatorios claves en el inicio y progresión del daño tisular. La vía de señalización intracelular JAK/STAT (Janus quinasa/Transductor de la señal y activador de la transcripción) regula un amplio rango de mediadores implicados en procesos de proliferación celular, inflamación y fibrosis, y es un importante mecanismo por el cual la hiperglicemia y la dislipemia contribuyen a la progresión de las complicaciones de la diabetes. Las proteínas SOCS (supresoras de la señal de citoquinas) constituyen uno de los principales mecanismos que regulan la magnitud y duración de la vía JAK/STAT. Este trabajo se ha centrado en el desarrollo de dos abordajes preclínicos basados en la proteína SOCS1, capaces de reducir la activación crónica de la vía JAK/STAT con el fin de prevenir el inicio y la progresión de la aterosclerosis y la nefropatía diabética. En primer lugar, se investigó el efecto ateroprotector y antiinflamatorio de la inhibición de JAK/STAT, mediante terapia génica con un adenovirus que codifica la proteína SOCS1, en un modelo experimental de aterosclerosis con ratones deficientes en apolipoproteína E (apoE-/-). La expresión del transgen SOCS1 atenuó la activación de STAT1 y STAT3 en aorta, redujo la expresión de sus genes dependientes (citoquinas, quimioquinas, moléculas de adhesión y receptores scavenger) y previno el desarrollo de aterosclerosis en fases tempranas, frenando también la progresión de las lesiones ateroscleróticas en fases avanzadas del modelo animal. Además, la terapia con SOCS1 promovió un fenotipo de placa más estable, caracterizado por un menor contenido de lípidos, linfocitos T y macrófagos M1 proinflamatorios y por un incremento de macrófagos M2 antiinflamatorios y colágeno. A nivel sistémico, la terapia génica con SOCS1 redujo la expresión de citoquinas de respuesta linfocitaria Th1 y Th17 y el estado de activación de los monocitos circulantes. En experimentos in vitro, SOCS1 inhibió la activación de STAT1 y STAT3 y la expresión de genes proinflamatorios en células vasculares y macrófagos estimulados con citoquinas y también redujo la proliferación y la migración celular. En segundo lugar, desarrollamos un péptido sintético con permeabilidad celular y que contiene la región inhibidora de quinasa (KIR) de la proteína SOCS1 para el tratamiento experimental de la aterosclerosis y la nefropatía asociadas a diabetes en un modelo de diabetes por inyección de estreptozotocina en ratones apoE-/-. La administración del péptido derivado de SOCS1 no afectó a la hiperglicemia ni al perfil lipídico de los animales diabéticos. Sin embargo, este tratamiento mostró un efecto ateroprotector en los ratones diabéticos, de manera que la supresión de la activación de STAT1 y STAT3 en la aorta redujo de forma efectiva el tamaño y extensión de las placas de ateroma tanto en fases iniciales como en fases avanzadas del proceso aterosclerótico. Además, las lesiones ateroscleróticas de los animales tratados con el péptido SOCS1 se caracterizaron por un menor contenido de lípidos, linfocitos T y macrófagos, y un mayor contenido de colágeno y células de musculo liso vascular, parámetros indicativos de estabilización de la placa. Asimismo, el tratamiento redujo la expresión de citoquinas proinflamatorias y el estrés oxidativo en el tejido aórtico. Por otra parte, los estudios en tejido renal demostraron el efecto protector del péptido derivado de SOCS1 en la nefropatía diabética experimental. El tratamiento mejoró significativamente la función renal y las lesiones renales asociadas a diabetes (expansión mesangial, infiltrado leucocitario y fibrosis) y redujo la activación de STAT1 y STAT3 y la expresión de genes proinflamatorios y profibróticos en el riñón diabético. Es de destacar que ninguno de estos efectos se observó en los animales tratados con el péptido mutante, utilizado en estos estudios como control estructural. In vitro, el péptido SOCS1 suprimió la activación de STAT y la expresión de sus genes dependientes en células vasculares y renales estimuladas con citoquinas y redujo procesos de proliferación, migración y adhesión celular. En conclusión, estos estudios demuestran que la inhibición de la vía JAK/STAT basada en la acción de la proteína reguladora SOCS1 suprime la inflamación y retarda la progresión del daño vascular y renal en ratones diabéticos, proporcionando así las bases para el desarrollo de nuevas terapias frente a las complicaciones inflamatorias de la diabetes.

Diabetes mellitus is a highly prevalent systemic disease worldwide that triggers a series of chronic complications which reduce the quality of life of patients. Among these complications, atherosclerosis and nephropathy are the leading cause of morbidity, mortality and chronic kidney disease in diabetic patients, given that current therapies are unable to effectively stop the occurrence of cardiovascular events or the progression to kidney failure. Furthermore, atherosclerosis and diabetic nephropathy share similar pathological features, including the activation of inflammatory mechanisms that play a crucial role in all stages of tissue damage. The JAK/STAT (Janus kinase/Signal transducer and activator of transcription) intracellular signaling pathway regulates a broad range of mediators implicated in cell proliferation, inflammation and fibrosis and is an important mechanism whereby hyperglycemia and dyslipidemia contribute to the progression of diabetic complications. Among the mechanisms controlling the activation and duration of JAK/STAT, the suppressors of cytokine signaling (SOCS) proteins are highlighted. This study addresses the preclinical development of two different SOCS1-based therapeutic approaches targeting chronic activation of JAK/STAT to prevent the initiation and progression of atherosclerosis and diabetic nephropathy. Firstly, we investigated the atheroprotective and antiinflammatory effect of JAK/STAT inhibition by gene therapy with a SOCS1-encoding adenovirus in an experimental model of atherosclerosis in apolipoprotein E deficient mice (apoE-/-). SOCS1 transgene expression in mouse aorta attenuated STAT1 and STAT3 activation and the expression of STAT-dependent genes (cytokines, chemokines, adhesion molecules and scavenger receptors), therefore preventing early development of atherosclerosis and further progression to advanced lesions. Furthermore, SOCS1 gene delivery promoted a more stable plaque phenotype characterized by lower content of lipids, T lymphocytes and proinflammatory M1 macrophages and higher content of antiinflammatory M2 macrophages and collagen. Systemically, SOCS1 gene therapy reduced the expression of Th1 and Th17 cytokines and the activation state of circulating monocytes. In vitro, SOCS1 prevented STAT1 and STAT3 activation and proinflammatory gene expression in cytokine-stimulated vascular cells and macrophages, and also reduced cell proliferation and migration. Secondly, we developed a synthetic cell-permeable peptide containing the kinase inhibitory region (KIR) of SOCS1 as an experimental therapy for diabetes-associated atherosclerosis and nephropathy in streptozotocin-induced diabetic apoE-/- mice. Administration of SOCS1-derived peptide did not affect hyperglycemia and lipid profile in diabetic mice but resulted in atheroprotection. Indeed, SOCS1 peptide therapy suppressed STAT1 and STAT3 activity in mouse aorta and effectively reduced the size and extension of atheroma plaques at both early and advanced stages of atherosclerosis. Furthermore, atherosclerotic lesions of peptide-treated mice exhibited a reduced content of lipids, T lymphocytes and macrophages, and increased collagen and smooth muscle cell content, indicating a more stable plaque phenotype. Likewise, SOC1 peptide treatment reduced proinflammatory cytokine expression and oxidative stress in the aortic tissue. On the other hand, studies in kidney tissue revealed a protective effect of SOCS1 peptide in experimental diabetic nephropathy, as evidenced by a significant improvement of renal function and renal lesions (mesangial expansion, leukocyte infiltration and fibrosis). Treatment also attenuated STAT1 and STAT3 activation and reduced the expression of proinflammatory and profibrotic genes in diabetic kidneys. It is noteworthy that no significant effects were observed in mice treated with mutant peptide, the structural control. In vitro, SOCS1 peptide suppressed STAT activation and STAT-target gene expression in cytokine-stimulated vascular and renal cells, therefore preventing cell proliferation, migration and adhesion. Collectively, our studies demonstrate that SOCS1-based inhibition of JAK/STAT signaling pathway suppresses inflammation and retards the progression of vascular and renal injury in diabetic mice, thus providing the basis for the development of new therapies against diabetes inflammatory complications.

Tesis doctoral inédita leída en la Universidad Autónoma de Madrid, Facultad de Medicina, Departamento de Farmacología. Fecha de lectura: 19-02-2016

Esta tesis tiene embargado el acceso al texto completo hasta el 19-08-2017