La comunidad científica necesita de nuevas tecnologías y métodos que permitan profundizar en el entendimiento de los distintos procesos biológicos. En esta tesis presentamos nuevos abordajes en microscopía óptica que permiten resolver algunas de las limitaciones existentes en este campo. Por una parte, presentamos el desarrollo de un nuevo método denominado FRET que posibilita medir la interacción entre moléculas utilizando el fenómeno de transferencia de energía de la fluorescencia por resonancia, que permite resolver muchas de las limitaciones de los métodos existentes, haciendo este tipo de estudios más fiables y sensibles cuando se compara con algunos de los métodos más usados. Este nuevo método ha sido validado en estudios de interacción entre las moléculas CD44 y MT1-MMP, demostrando su utilidad en el campo. Aun así, el mayor inconveniente de dicho tipo de ensayos y en general de las adquisiciones de imagen complejas es el gran consumo de tiempo y recursos. Las opciones disponibles de automatización son aún muy básicas y poco eficientes. Por ejemplo, las técnicas de screening convencional (o adquisición aleatoria automatizada) necesitan de muestras homogéneas y con una localización estandarizada que muchas veces resulta imposible de conseguir en biología, ya sea por la baja frecuencia del evento de estudio como por su heterogeneidad. En este trabajo presentamos también el desarrollo y validación de una nueva técnica de “screening inteligente” denominado iMSRC (Intelligent Matrix Screening Remote Control) que posibilita realizar de forma fácil e intuitiva la adquisición de imágenes dirigida por análisis de imagen automatizada en microscopios de fluorescencia estándar y en microscopios confocales. Esta nueva herramienta permite la realización de estudios de microscopía óptica basados en la localización de eventos de baja frecuencia en una muestra y otros ensayos complejos, que antes eran prácticamente inviables.

The scientific community needs new technologies and methods which may allow us to study biological processes in depth. In this Ph.D. Thesis we present new approaches in optical microscopy which that allow solving some of the current limitations in this field. On the one hand, we present here the development of a new method named FRET which allows the measurement of molecular interactions by using the fluorescence resonance energy transfer phenomenon. This novel method overcomes most of the limitations from previously existing methods. The measurements with this new method proved to be more reliable and sensitive than most common ones based in optical microscopy. Furthermore, we have validated this method in the study of the interaction between CD44 and MT1MMP. The main problem of this kind of assays and of complex image acquisition in microscopy in general is that they require long acquisition time and resources. The currently available options for automation are still very simple and poorly efficient. For example conventional screening approaches (random automated acquisition of images) require homogenous samples and the location of the events of interest must be predefined. This is often difficult to achieve in most common assays characterized by biological heterogeneity or when trying to quantify rare events. To overcome these limitations we have developed and validated the iMSRC (intelligent matrix screening remote control), a new platform for running intelligent screenings (automated acquisition driven by image analysis) in a user friendly manner, and compatible with conventional and confocal microscopes. This new approach allow performing microscopy studies based on the detection of low frequency events in a sample and other complex assays that were almost impossible before.

Tesis doctoral inédita, leída en la Universidad Autónoma de Madrid, Facultad de Medicina, Departamento de Bioquímica. Fecha de lectura: 08 de febrero de 2016