En esta Tesis Doctoral se presenta la purificación y caracterización enzimática de una nueva primasa humana de la superfamilia AEP (primasas arqueo eucariotas). Ccdc111 había sido identificada como un miembro potencial de la superfamilia AEP mediante comparaciones de secuencia de aminoácidos. El gen CCDC111 humano fue subclonado, y la proteína ccdc111 fue sobre-expresada de forma heteróloga en Escherichia coli. Ccdc111 fue estabilizada por adición de una cola de histidinas en su extremo amino, lo que posteriormente ayudó a su purificación mediante columnas de afinidad. Se pudo obtener una fracción pura y en concentración suficiente para realizar un detallado análisis enzimático. En este trabajo se demuestra que, en efecto, ccdc111 posee actividad RNA primasa por ser capaz de utilizar ribonucleótidos para la síntesis de iniciadores (como las primasa convencionales), pero también que es capaz de hacerlo a partir de deoxirribonucleótidos, por lo que posee actividad DNA primasa. El estudio en detalle de su actividad primasa ha revelado que ccdc111 tiene la misma afinidad por los NTPs que por los dNTPs como sustratos del sitio 5´ o sitio de iniciación. Sin embargo, presenta una preferencia 100 veces mayor por utilizar dNTPs para el sitio 3´ o sitio de elongación. Con respecto a la distinción de determinadas secuencias como señal de reconocimiento y comienzo de la síntesis de iniciadores, ccdc111 reconoce un trímero formado por: una Guanina en primera posición, como nucleótido críptico (que es reconocido pero no copiado); una Pirimidina en segunda posición, de modo que empieza la síntesis usando una purina (fisiológicamente más abundantes) y un tercer nucleótido sobre el que no se ha detectado especial predilección. Ccdc111 fue capaz de elongar un iniciador pre-existente, demostrando que posee, además, actividad DNA y RNA polimerasa. Debido a la dualidad de ccdc111 como primasa y polimerasa, se modificó su nomenclatura (aprobada por el comité HUGO), llamándose ahora PrimPol. Se identificaron los residuos responsables de la catálisis en el centro activo de PrimPol, tanto de su actividad primasa como de su actividad polimerasa. PrimPol es una DNA polimerasa distributiva, que inserta dNTPs siguiendo el dictado de una cadena molde con unos niveles moderados de fidelidad, a pesar de carecer de actividad correctora de errores. Además, PrimPol polimeriza eficientemente a través de lesiones en el DNA como el 8oxoG, los sitios abásicos, o los dímeros de timinas (del tipo CPD), entre otros daños en el DNA. Estos resultados apoyan la función de PrimPol en tolerancia al daño durante la replicación de DNA. PrimPol posee un dominio dedo de zinc en su extremo C-terminal, que es esencial para la actividad primasa. Sin embargo, el dedo de zinc resulta ser no solo prescindible para su actividad polimerasa, sino que su eliminación incrementa la eficiencia de polimerización, disminuyendo la KM por los dNTPs. Estudios de locación subcelular revelaron que PrimPol se encuentra tanto en el núcleo como en la mitocondria. PrimPol podría estar ejerciendo una función auxiliar durante la replicación del DNA nuclear llevada a cabo por Polε y Polδ, y del DNA mitocondrial por Polγ. PrimPol asistiría a las DNA polimerasas replicativas de ambos compartimentos celulares, que se hubieran detenido frente a una lesión en el DNA molde, actuando como DNA polimerasa de translesión o sintetizando nuevos iniciadores cerca de la lesión, permitiendo así la progresión de la horquilla de replicación.

This Doctoral Thesis reports the purification and biochemical characterization of a novel human primase belonging to the AEP (Archeo Eukaryotic Primases) superfamily. Ccdc111 had been identified as a putative AEP new member by amino acid sequence comparisons. The human gen CCDC111 was cloned, and ccdc111 was overexpressed in Escherichia coli. Ccdc111 was stabilized by adding a histidine tag at its N-terminus, that also facilitated purification through affinity columns. Both the purity achieved and the high yield obtained, allowed a detailed enzymatic analysis of ccdc111 This work shows that, in fact, ccdc111 has RNA primase activity, as it is able to use ribonucleotides to make primers (as conventional primases do), but strikingly, it can initiate synthesis from deoxynucleotides, thus being also a DNA primase. The detailed study of its primase activity demonstrated that ccdc111 has the same affinity for NTPs than for dNTPs as substrates for the 5´ site (initiation site); however, ccdc111 displays a 100 higher preference for dNTPs at the 3´ site (elongation site). Among the specific template sequences preferred to initiate primer synthesis, ccdc111 recognizes a trinucleotide consisting in: a guanine at the first position, as a cryptic nucleotide (that is recognized but not copied); a pyrimidine at the second position, dictating the start with a purine nucleotide (physiologically more abundant); and any of the four dNTPs at the third position. Ccdc111 was able to elongate a pre-existing primer, also demonstrating DNA and RNA polymerase activities. Such a duality of ccdc111 as a primase and polymerase, prompted us to modify its name to PrimPol (approved by the HUGO committee) The catalytic residues forming a common active site responsible for both primase and polymerase activities of PrimPol have been identified. PrimPol is a distributive DNA polymerase, that inserts dNTPs by copying a template chain with a moderate fidelity, in spite of the lack of proofreading activity. Moreover, PrimPol tolerates lesions in the template strand as 8oxoG, abasic sites, or thymidine dimers (CPD), to name a few. These results support a role of PrimPol in damage tolerance coupled to DNA replication. PrimPol has a zinc finger domain at its C-terminus, shown to be crucial for the primase activity. Strikingly, the zinc finger domain is not only dispensable for the polymerase activity of PrimPol, but its deletion does enhance polymerization efficiency by decreasing the KM for dNTPs. Subcellular localization analysis showed that PrimPol is present at both nucleus and mitochondria. PrimPol could have an auxiliary role during nuclear DNA replication by Polε y Polδ; and during mitochondrial DNA replication by Polγ. PrimPol would assist replicative DNA polymerases from both compartments, when they become stalled opposite DNA lesions, by acting as a translesion synthesis polymerase or by synthesizing a new primer near the lesion allowing the progression of the replication fork.

Tesis doctoral inédita, leída en Universidad Autónoma de Madrid, Facultad de Ciencias, Departamento de Biología Molecular. Fecha de lectura: 17/07/2013