O “Challenger Deep” na Fossa das Marianas é um dos ambientes mais extremos à face da Terra. A combinação da baixa temperatura de 2.5ºC, e a pressão de quase 112MPa, devido à coluna de água de 11km, tornam-no único, e sujeito à curiosidade humana por esse facto. Contudo, os métodos tradicionais de cultura microbiana em laboratório tornavam muito difícil obter uma visão completa da comunidade que habita esse ambiente, uma vez que nem todos os microorganismos são passíveis de ser cultivados, nem as condições extremas simples de ser recriadas. Em 1998, Jo Handeslman cunhou o termo “Metagenómica”, ao tentar estudar a microflora como um todo, em vez de estudar organismos individuais, denominando-o assim de metagenoma. Desde aí que a Metagenómica evoluiu, passando a englobar a identificação de sequências genómicas duma comunidade, bem como a sua análise funcional e evolutiva. A análise metagenómica tipicamente inclui vários passos que começam na amostragem, seguindo-se a filtração (embora esta seja facultativa, dependendo do objectivo do estudo), a sequenciação, até à análise das sequências e publicação dos dados gerados. Este trabalho lidou exclusivamente com os dois últimos passos. O objectivo do trabalho foi, não só gerar mais questões, como é habitual em análises metagenómicas, mas também investigar que comunidade habita este ambiente, e explorar um pouco o seu potencial metabólico. Contudo, com a publicação de um estudo que descreve as mesmas amostras, surgiu o objectivo de explorar os resultados no sentido de corroborar a descoberta de que há consumo de oxigénio ao longo do sedimento. A análise seguiu os moldes normalmente usados em trabalhos semelhantes. De 8 amostras iniciais, correspondendo a intervalos de 5cm da superfície até 40cm de profundidade do sedimento, 7 foram sequenciadas. Inicialmente, as sequências foram automaticamente pré-processadas de forma a que apenas a informação relevante e fidedigna passasse à fase seguinte. Nomeadamente, removeram-se os adaptadores utilizados na sequenciação, bem como sequências demasiado curtas, e bases de má qualidade. Para isto, foi utilizada a colecção de ferramentas “Biopieces”, que permite organizar os comandos numa pipeline de uma forma simples e intuitiva. Seguidamente, as sequências foram sujeitas a assemblagem, utilizando o programa IDBA-UD, de forma a gerar sequências mais longas, para serem anotadas com maior percentagem de identidade, e consequentemente, com maior confiança. Mais uma vez, este passo é facultativo, uma vez que ao assemblar sequências perde-se informação relativamente à abundância. Antes da anotação, as sequências foram classificadas de codificantes ou não codificantes, e as primeiras foram então mapeadas contra sequências conhecidas em bases de dados. A anotação foi feita em termos taxonómicos e funcionais. Todos os passos que se seguiram à assemblagem foram realizados pelo servidor MG-RAST, no entanto, tanto sequências assembladas (“contigs”) como não-assembladas (“reads”) foram submetidas, para haver informação relativamente à abundância, mas também informação sólida relativamente a determinadas características de interesse. Os resultados gerados pelo MG-RAST mostram claramente que Betaproteobacteria domina a amostra de superfície (0-5cm), enquanto que nas restantes amostras é a classe Gammaproteobacteria a mais abundante. É interessante observar que enquanto que Gammaproteobacteria nas amostras 1 (0-5cm) e 2 (5-10cm) é dominada por um género, da amostra 3 (10-15cm) à 8 (35-40cm) o número de géneros abundantes aumenta. Em termos de diversidade-alfa, a amostra 1 apresenta o valor mais elevado (430.83 espécies), em comparação com as outras que variam entre 184.10 e 252.14 espécies. A diversidade-beta foi calculada entre todas as amostras, usando o pacote “vegan” da linguagem de programação estatística R. Especulou-se que poderia haver uma correlação entre esta e a profundidade, mas tal não se verificou. Para averiguar se haveria alguma relação entre a profundidade do sedimento e a composição da comunidade, utilizou-se a análise de componentes principais (PcoA). Estes resultados não permitiram a confirmação da hipótese, no entanto, ao comparar com amostras de outros projectos bastante diferentes, as amostras da Fossa das Marianas agruparam-se de modo consistente, mostrando que a composição da comunidade é característica deste ambiente. Além disto, gerou-se uma curva de rarefacção, que é utilizada para verificar se o esforço de sequenciação foi suficiente para representar a comunidade por inteiro, e dado que as curvas das 7 amostras estão a chegar perto da assímptota, pôde-se concluir que os resultados são razoáveis. Em termos funcionais, a análise focou-se no metabolismo energético. A maior parte das sequências “reads” deste metabolismo mapeavam para fosforilação oxidativa, que é o último passo da respiração aeróbia. Analisando as sequências “contigs” que mapeavam para o mesmo, verificou-se que existia mais de 91% de identidade contra sequências na base de dados escolhida, o que indica que os resultados são credíveis. O metabolismo do metano e do azoto foram também investigados e, apesar de menos abundantes, algumas enzimas envolvidas na metanogénese e no ciclo do azoto foram identificadas nas sequências “contigs”. Finalmente, gerou-se um mapa geral com todas as enzimas identificadas nas amostras, utilizando o programa iPath que se baseia nos mapas metabólicos KEGG. É de notar, todavia, que este mapeamento pode ser erróneo, como se constatou quando se observou que a fotossíntese estava indicada como presente, o que é altamente improvável a 11km de profundidade. Quando se investigou porquê, descobriu-se que era devido a uma ATPase que está presente tanto na fotossíntese como na fosforilação oxidativa. Os resultados gerados, permitem concluir que efectivamente o consumo de oxigénio, medido no estudo efectuado por colaboradores, se deve a metabolismo aeróbio mesmo nas camadas de sedimento mais profundas. Esse estudo também previu que os processos de mineralização acentuados neste ambiente fossem mediados pela comunidade microbiana, o que se coaduna com a presença de enzimas envolvidas no ciclo do azoto. A dominância de Gammaproteobacteria é partilhada por sedimentos no Oceano Pacífico a 4000m de profundidade, bem como sedimentos no Oceano Pacífico Ártico, que se encontra igualmente a baixas temperaturas. Curiosamente, a microflora de fontes hidrotermais em profundidade, a mais de 310ºC também são dominadas por Gammaproteobacteria. Este estudo mostrou que é possível investigar em detalhe a composição da comunidade bacteriana de ambientes extremos. Contudo, este trabalho poderia ter sido mais robusto se houvesse réplicas das unidades amostrais, e mais dados contextuais que permitissem fazer comparações com outros estudos. No futuro, seria também interessante tirar amostras a diversas profundidades do “Challenger Deep” de forma a estudar a variação da composição da comunidade com a profundidade. Uma vez que esta área é ainda bastante jovem, a colecção de ferramentas disponíveis apesar de vasta, ainda está sujeita a melhoramentos. Desta forma, os resultados aqui apresentados poder-se-ão revelar imprecisos daqui a 10 anos. Também é provável que uma escolha alternativa não produzisse exactamente os mesmos resultados. Assim, o produto deste trabalho é fruto da escolha das ferramentas e dos seus parâmetros, com todas as vantagens e incovenientes que lhes são inerentes.

The emergence of Metagenomics allowed the study of the microbial community in the deepest point on Earth: the Challenger Deep on the Mariana Trench. Its extreme conditions, a water depth of almost 11km, a temperature of 2.5 degrees Celsius and a pressure around 112 MPa, made it very difficult to perform a comprehensive study of its microecology, given the previous dependency on culturing methods. This metagenomic analysis included taxonomic identification and exploration of some functional potential of the genomic sequences of the community, generated by Illumina Next-Generation Sequencing technique, therefore bypassing the need for cloning. Here we show that Proteobacteria clearly dominate this environment but that there is no obvious correlation between the sediment depth and the community composition. Moreover, the abundance of enzymes involved in oxidative phosphorylation in all samples, suggests aerobic activity within the sediment. This supports the finding that there is oxygen consumption along the depth of the sediment. An extensive description of all the data generated was prohibitive; however as soon as the data becomes available, it will be accessible to the public to search for their features of interest.

Tese de mestrado em Bioinformática e Biologia Computacional (Bioinformática), apresentada à Universidade de Lisboa, através da Faculdade de Ciências, 2013