Eucalyptus grandis é uma das espécies, dentro do género Eucalyptus, com maior interesse económico a nível mundial. A transformação genética em Eucalyptus pode contribuir para a introdução de caracteres de interesse económico, que permitam melhorar a produtividade e qualidade da madeira e outros produtos, ou conferir resistência a pragas, doenças ou condições ambientais. Os sistemas de transformação requerem um sistema de regeneração de plantas in vitro eficiente, via embriogénese somática ou organogénese. Neste trabalho, para obtenção de embriogénese somática, foram estudadas mais de 30 condições diferentes a partir de explantes foliares, caulinares (entrenós) e radiculares. Embora não se tenham obtidos embriões somáticos, alguns tratamentos apresentaram organogénese de raízes (os melhores resultados obtiveram-se em 2 e 3 mg/L de NAA). A regeneração por organogénese foi testada em 10 condições diferentes, com sucesso em 80% dos tratamentos (obtenção de gemas adventícias e plântulas). Os melhores resultados foram obtidos nas combinações BA (2mg/L) e NAA (1mg/L), em meio WPM, e BA (2mg/L) e NAA (0,5mg/L), em meio MS. O isolamento das plântulas regeneradas em condições de crescimento apical e, posteriormente, em condições de enraizamento, resultou na obtenção de plantas completas de Eucalyptus grandis. Procedeu-se também à transformação de explantes foliares com a estirpe EHA105 de Agrobacterium tumefaciens que, resultou na regeneração de raízes, quando submetidos a meio de selecção (10mg/L de canamicina) suplementado com 2mg/L de NAA (indução da organogénese de raízes). A eficiência de transformação, pelo protocolo apresentado neste trabalho, é de 2,3%. Quando submetidas a microscopia de epifluorescência (λex=480/40nm) as raízes regeneradas a partir de explantes infectados emitiram fluorescência, confirmando a expressão de GFP nas raízes regeneradas transgénicas.

Eucalyptus grandis is one of the species, within the Eucalyptus genus, with most significant economical importance worldwide. Genetic transformation in Eucalyptus may contribute to increase productivity by the introduction of desirable traits, such as pest resistance and improvement of wood quality. However, the prerequisite for the success of the transformation strategy is the establishment of an efficient in vitro regeneration system, either through somatic embryogenesis or organogenesis. In this work over 30 different conditions were studied, in order to achieve somatic embryogenesis, while using leaves, roots and internodal segments as explants. Although the production of somatic embryos wasn’t successful, some treatments showed root organogenesis (best results achieved with 2 and 3mg/L of NAA). Plant regeneration through organogenesis was tested in 10 different conditions, with 80% of these being successful (induction of adventitious shoots and plantlets conversion). The best organogenesis results were reported with the combination of BA (2mg/L) plus NAA (1mg/L), in WPM medium, and BA (2mg/L) plus NAA (0,5mg/L), in MS medium. The isolation of regenerated plantlets on shoot growth and rooting medium allowed the regeneration of Eucalyptus grandis whole plants. Transformation of leaf explants was achieved using the EHA105 strain of Agrobacterium tumefaciens, resulting in root regeneration, when submitted to a selection medium (10mg/L of kanamycin) supplemented with 2mg/L of NAA (root organogenesis induction medium). With the protocol described in this work, the transformation efficiency was 2,3%. When submitted to epifluorescence microscopy (λex=480/40nm), the regenerated roots, derived from infected explants, emitted green fluorescence, thus confirming GFP expression in the regenerated transgenic roots.

Tese de mestrado. Biologia (Biologia Celular e Biotecnologia). Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2012