As micotoxinas são toxinas naturais presentes maioritariamente nos alimentos sendo produzidas por várias espécies de fungos (Aspergillus, Fusarium e Penicillium). A aflatoxina B1 (AFB1) é o carcinógeno hepático mais potente conhecido em mamíferos, sendo classificada pela IARC no Grupo 1 (carcinogénico para humanos). A exposição a AFB1 pode afetar a população em geral, existindo um interesse crescente dos seus efeitos deletérios no trato gastrointestinal, dado as células epiteliais do intestino constituírem a primeira linha de defesa do organismo humano. Existem poucos dados disponíveis sobre o efeito de AFB1 no muco, uma importante barreira de proteção intestinal, sendo importante desenvolver estudos sobre os efeitos desta micotoxina em culturas de células intestinais produtoras de muco, o que não foi efetuado até ao momento. O objetivo deste trabalho consistiu no desenvolvimento de um estudo comparativo sobre os efeitos da AFB1 em culturas de células Caco-2 e co-culturas Caco-2/HT29-MTX-E12 (produtoras de muco). Utilizou-se várias metodologias in vitro incluindo um ensaio de citotoxicidade de AFB1; monitorização do crescimento/polarização da monocamada das células; ensaio de transporte da micotoxina através da membrana intestinal com verificação da integridade das células expostas através da resistência elétrica transepitelial (TEER) e microscopia de imunofluorescência confocal para avaliação da morfologia das células. Os resultados demonstraram que ambas as linhas celulares foram adequadas para a realização de estudos de exposição a micotoxinas. Verificou-se que a AFB1 afetou a integridade da membrana celular, existindo uma diminuição da TEER em função do tempo de exposição e alterações na morfologia das células expostas, em ambas as linhas celulares. Concluiu-se assim que o modelo de co-cultura mimetizou melhor as condições do intestino humano e evidenciou-se a ação da AFB1 na integridade das células da barreira intestinal. Nas co-culturas Caco-2/HT29-MTX-E12 os efeitos da AFB1, não foram tão evidentes, demonstrando-se assim o papel fundamental do muco enquanto barreira protetora.

Mycotoxins are natural toxins present mostly in food and are produced by several species of fungi (Aspergillus, Fusarium and Penicillium). Aflatoxin B1 (AFB1) is the most potent liver carcinogen known in mammals and is classified by the IARC in Group 1 (carcinogenic to humans). Exposure to AFB1 can affect the general population, and there is a growing interest in its deleterious effects on the gastrointestinal tract, given that intestinal epithelial cells constitute the first line of defense of the human organism. There are few data available on the effect of AFB1 on mucus, an important intestinal protective barrier, thus it is important to develop studies on the effects of this mycotoxin on cultures of intestinal mucus-producing cells, which has not been done so far. The objective of this work was to develop a comparative study on the effects of AFB1 in Caco-2 cell cultures and Caco-2/HT29-MTXE12 co-cultures (mucus producing cells). Various in vitro methodologies were used including an AFB1 cytotoxicity assay; growth/polarization monitoring of cell monolayers; mycotoxin transport assay through the intestinal membrane with evaluation of the integrity of exposed cells through transepithelial electrical resistance (TEER) and confocal immunofluorescence microscopy to evaluate cells morphology. The results showed that both cell lines were suitable for performing mycotoxin exposure studies. It was found that AFB1 affected the integrity of the cell membrane, with a decrease in TEER as a function of exposure time and changes in the morphology of exposed cells, in both cell lines. It was concluded that the co-culture model better mimicked the conditions of the human intestine, and it was evidenced the action of AFB1 on the integrity of intestinal barrier cells. In the Caco-2/HT29-MTX-E12 co-cultures, the harmful effect of AFB1 on membrane integrity was not so evident, thus demonstrating the fundamental role of mucus as a protective barrier.

Tese de Mestrado, Biologia Humana e Ambiente, 2022, Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências