Os nucleósidos são compostos envolvidos em vários processos celulares como síntese de RNA e DNA, sinalização celular, regulação enzimática e metabolismo. Análogos destes compostos são frequentemente usados no tratamento de infeções virais e fúngicas, assim como no tratamento do cancro. No entanto, são poucos explorados como agentes bacterianos. Vários produtos naturais com uma estrutura nucleosídica já foram descritos como tendo atividade inibitória na síntese da parede celular bacteriana, pela inibição da síntese do peptidoglicano, o constituinte principal das paredes celulares das bactérias Gram-positivas e Gram-negativas. Numa primeira parte do trabalho foram sintetizados e purificados, análogos de açucares de nucleósidos difosfato com potencial inibitório das enzimas Mur, essenciais para a biossíntese do peptidoglicano, de modo a posteriormente avaliar o seu efeito como agente antibacteriano. As enzimas Mur possuem o mesmo mecanismo catalítico e partilham caraterísticas estruturais que podem ser concebivelmente exploradas para o desenvolvimento de inibidores capazes de visar simultaneamente mais do que um enzima, ou seja os compostos sintetizados pretendem mimetizar açúcares de nucleósido difosfato, baseados em UDP-MurNac, que são os substratos das enzimas Mur, o que forneceria antibacterianos com direcionados a vários alvos e com uma probabilidade minimizada de desenvolvimento de resistência do que aquela observada quando apenas um alvo é visado. Para tal, foram sintetizados, novos nucleósidos pseudossacarídicos nos quais um sistema (triazolil)metil amida conecta as unidades glicosídicas em C-6. A via sintética consistiu na síntese separada de precursores nucleosídicos derivados de Npropargil glucuronamina e de 6-azidoglucósido de metilo e no acoplamento posterior dessas moléculas através de uma unidade 1,2,3-triazole usando reações de cicloadição 1,3-dipolar. A natureza das bases azotadas do percursor N-propargil glucuronamina foi variada, usando 6-cloropurina, 2-acetamino-6-cloropurina, uracilo e timina. A caraterização dos compostos foi realizada por RMN, usando as técnicas 1H RMN, 13C RMN, COSY, HMQC e HMBC. Na segunda parte do trabalho foi avaliada a atividade biológica de 17 compostos, incluindo os análogos de açucares de nucleósido difosfato sintetizados, precursores nucleosídicos, bem como outros análogos de nucleós(t)idos contendo unidades de 1,2,3-triazole, anteriormente sintetizadas no grupo, pelo método da microdiluição em placas de 96 poços. A determinação da concentração inibitória mínima (CIM) foi realizada através da identificação das concentrações que impediam o aparecimento de turbidez no meio resultante do crescimento bacteriano após incubação de 24 h de incubação a 37℃. Para o ensaio foram utilizadas estirpes de bactérias Gram-positivas (S. pneumoniae, estirpe D39) e Gram-negativas (E. coli, estirpe DH5α). Dos compostos analisados, identificou-se um isonucleósido de triazolefosfonato, (composto 34) que se mostrou ativo contra S. pneumoniae com a CIM entre 3,91 a 7,81 mg/L, uma atividade antibacteriana melhor do que da fosfomicina face a S. pneumoniae, com CIM entre 32 e 64 mg/L. O efeito antibacteriano deste composto foi confirmado através da realização de uma curva de crescimento da S. pneumoniae na presença de 34, para determinar a taxa de crescimento e o tempo de duplicação de S. pneumoniae nas condições utilizadas.

Nucleosides are compounds involved in multiple cellular processes such as RNA and DNA synthesis, cell signaling, enzyme regulation and metabolism. Analogs of these compounds are frequently used in the treatment of viral and fungal infections, as well as in the treatment of cancer. However, they have been not sufficiently explored as bacterial agents. Several natural products having a nucleoside structure with inhibitory activity on bacterial cell wall synthesis have already been described, by inhibiting the synthesis of peptidoglycan, the main constituent of the cell walls of Grampositive and Gram-negative bacteria. In the first part of the work, sugar analogues of nucleoside diphosphate with inhibitory potential for Mur enzymes were synthesized and purified to evaluate their effect as antibacterial agent. Mur enzymes are essential for peptidoglycan synthesis, they have the same catalytic mechanism and share structural features that can conceivably be exploited for the development of inhibitors that simultaneously target more than one enzyme. The synthesized compounds intend to mimic nucleoside diphosphate sugars, based on UDP- MurNac, which are the substrates of Mur enzymes, which would provide multi-targeting antibacterial with a minimized probability of development of target-mediated resistance. Therefore, pseudossacharide nucleosides were synthesized in which a (triazolyl)methyl amide system is connected to a glycosidic unit at C-6. The synthetic pathway consisted of the separate synthesis of nucleoside precursors derived from N-propargyl glucuronamide and methyl 6-azido glucoside, and the subsequent coupling of these molecules by a 1,2-dipolar cycloaddition originating a 1,2,3-triazole unit. The nature of the nitrogenous bases of the precursor N-propargyl glucuronamide was varied, using 6-chloropurine, 2-acetamino-6-chloropurine, uracil and thymine. The characterization of the compound was performed by NMR (1H RMN, 13C RMN, COSY, HMQC and HMBC). In the second part of the work, the biological activity of 17 compound was evaluated by microdilution method in 96-well plates. The compounds were: the synthesized nucleoside diphosphate sugar analogues, nucleoside precursors, as well as other nucleoside(t)ide analogues containing 1,2,3-triazole units previously synthesized in the group. The determination of the minimum inhibitory concentration (MIC) was performed by identifying the concentrations that prevented the appearance of turbidity in the resulting medium of the bacterial growth after 24h incubation at 37℃. Gram-positive (S. pneumoniae D39) and Gram-negative (E. coli DH5α) bacteria strains were used for the assay. Of the tested compounds, a triazolephosphonate isonucleoside (compound 34) was active against S. pneumoniae with a MIC between 3,91 to 7,81 mg/L, an antibacterial activity greater than that of fosfomycin against S. pneumoniae, with MIC between 32 and 64 mg/L. The antibacterial effect of this compound was confirmed by carrying out the growth curve of S. pneumoniae in the presence of 34 to determine the growth rate and the doubling time under the used conditions.

Tese de Mestrado, Química, 2022, Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências