A distrofia muscular congénita deficiente na cadeia α2 da laminina (LAMA2-CMD) é causada por mutações recessivas no gene LAMA2. Esta doença neuromuscular é diagnosticada à nascença ou nos primeiros meses de vida e é caracterizada por hipotonia e fraqueza muscular grave. Utilizando o modelo de ratinho dyW para LAMA2-CMD, estudos anteriores do laboratório revelaram que o aparecimento desta distrofia muscular ocorre in utero, mais especificamente entre os estádios fetais 17.5 e 18.5 (E17.5-E18.5), sendo possível observar uma redução do tamanho das fibras musculares e uma menor expressão dos fatores miogénicos Pax7 e Miogenina. Estas alterações podem estar relacionadas com mudanças na regulação do ciclo celular e sobrevivência, como revelado pela sobreativação do fator de transcrição STAT3 e aumento de expressão do respetivo gene-alvo Pim1. No entanto, ainda não é claro quais as vias alteradas no início da LAMA2-CMD. Uma melhor compreensão das alterações no contexto da LAMA2-CMD é imperativa para o desenvolvimento de novas terapias. Este projeto visa analisar os mecanismos de destino celular que sofrem alterações durante o início desta doença e testar se estes podem ser contrariados pela supressão do fator de transcrição p53. Para isso, foram realizadas as seguintes tarefas: → Análise de vias envolvidas na regulação do ciclo celular e sobrevivência celular (incluindo quiescência/proliferação, apoptose, senescência e autofagia) que podem ser alteradas na ausência de Lama2 in vivo, comparando os músculos epaxiais de ratinho selvagens (wt) com ratinhos dyW em E17.5 e E18.5. Assim, será possível ter uma melhor compreensão dos mecanismos que desencadeiam o aparecimento desta condição, de modo a desenvolver novas terapias para o tratamento desta distrofia → Estabelecer e testar uma linha celular C2C12 mutante em Lama2, utilizando a tecnologia CRISPR/Cas9, para estudar a deficiência de laminina α2 in vitro. → Testar se a deleção de p53 na ausência de Lama2 melhora o fenótipo LAMA2-CMD in vitro. Para avaliar o impacto de alterações no ciclo celular e da sobrevivência no início da LAMA2- CMD, foram analisadas diferentes vias in vivo em ratinhos dyW e in vitro, utilizando células C2C12 com mutação em Lama2, recorrendo a várias técnicas de biologia celular e molecular, incluindo Real Time-qPCR (RT-qPCR), Western Blot, imunofluorescência, citometria de fluxo e análise de proliferação. A análise da expressão dos genes ligados à proliferação/quiescência nos músculos fetais revelou um aumento significativo na expressão de Cdkn1a (p21) e Cdkn1c (p57) em E17.5 e um aumento de expressão de Cdkn1a em E18.5, embora não significativo (p= 0,1263), sugerindo uma diminuição da proliferação e indução da paragem do ciclo celular. Em concordância, a deteção de histona H3 fosforilada por imunofluorescência e a análise da proliferação celular com Resazurina demonstraram uma redução da proliferação das células deficientes em Lama2 comparativamente com as células saudáveis (Wt). A análise complementar in vitro, feita por citometria de fluxo, mostrou que a diminuição da proliferação se poderá dever à paragem do ciclo celular, uma vez que os resultados demonstraram um aumento de células em fase G1/G0 quando comparadas com Wt, sugerindo que a deficiência em Lama2 poderá levar à paragem neste ciclo celular. Em condições de homeostase, o p53 está constantemente a ser degradado, no entanto, após algum tipo de stress, o p53 é estabilizado e ativado, regulando diferentes vias de sinalização. Estudos anteriores revelaram que este fator de transcrição, conhecido por desencadear a paragem do ciclo celular (por exemplo, através da indução da expressão Cdkn1a/p21, levando à paragem na fase G1), se encontrava induzido e acumulado nos núcleos das células miogénicas LAMA2-CMD humanas e em ratinhos Lama2-/- , resultado que está de acordo com o aumento dos níveis de expressão de p53 no músculo esquelético fetal em E18.5, detetados no presente trabalho. Assim, sugere-se que uma diminuição da expressão de p53 poderia recuperar defeitos proliferativos observados em condições de deficiência de Lama2. O papel deste fator de transcrição neste contexto foi avaliado pela redução da expressão de p53 combinado com mutações no gene Lama2 (dko), em células C2C12. Utilizando o ensaio de proliferação de Resazurina, foi possível verificar uma melhoria na proliferação celular dos clones dko, passando a ser semelhante ao Wt. A análise de genes envolvidos na regulação da autofagia in vivo revelou que a expressão de Lamp2a em E18.5 era semelhante para dyW e wt, mas a expressão de Atg7 revelou-se significativamente aumentada, demonstrando uma possível ativação da autofagia. Embora a apoptose seja uma marca típica em várias distrofias musculares, incluindo LAMA2-CMD, este processo não é aumentado nos músculos durante o desenvolvimento embrionário. Estes resultados estão de acordo com os nossos, uma vez que os valores de expressão de Bax e Bcl2 não foram significativamente alterados em comparação com os dos ratinhos wt. A apoptose só é significativa em contexto pós-natal, aquando da acumulação considerável de danos. Assim, é provável que o aumento da apoptose não seja a razão para a diminuição das células estaminais musculares e redução do tamanho da miofibras, de acordo com os resultados anteriores. Embora haja uma estreita relação entre autofagia e apoptose, a autofagia pode agir conjuntamente com a apoptose e induzir a morte celular ou, por outro lado, reprimi-la. Os resultados não foram conclusivos sobre esta ligação. A senescência caracteriza-se pela expressão do fenótipo secretor associado à senescência (SASPs), que incluem a secreção de várias citocinas inflamatórias e interleucinas. Os membros da família CCL podem aparecer regulados em células senescentes. Em concordância, o gene Ccl7, que codifica para o ligando 7 da quimiocina (motivo C-C) (CcL7), estava significativamente aumentado em ratinhos dyW, sugerindo que a senescência pode ser predominante neste genótipo. Il-6ra, que codifica para a cadeia alfa do recetor de Il-6, é um recetor ao qual se liga Il 6, desencadeando diferentes vias de transdução de sinal e transcrição de diversas citocinas que medeiam respostas inflamatórias e senescência. Para além disso, está envolvido na ativação da via JAK-STAT3, que pode levar tanto à proliferação dos mioblastos e prevenção de diferenciação prematura com à diferenciação miogénica. A expressão Il-6ra estava aumentada em ratinhos dyW em E17.5 (p=0,0943), mas a expressão em E18.5 foi semelhante para ambos os genótipos. Em consonância, a fosforilação de STAT3 em dyW revelou uma tendência a estar aumentada em comparação com o wt, embora não fosse significativo, em concordância com resultados anteriormente obtidos. Assim, Il-6ra poderá contribuir para uma maior ativação do JAK-STAT. A sobreactivação de JAK-STAT3 tem sido demonstrada como sendo característica das MuSCs envelhecidas que apresentam uma regeneração muscular deficiente e, para além disso, foi também sugerido o seu envolvimento na promoção das divisões assimétricas das MuSCs. Portanto, existe a possibilidade da laminina-211 estar envolvida no controlo da ativação de STAT3, através da ligação e ação da integrina α7β1 (integrina esta que se liga a Lama2), e impeça a sobreactivação da via JAK-STAT3, favorecendo assim as divisões simétricas para manter a população de MuSCs Pax7 positivas. Para além disso, a sobreactivação JAK-STAT3 poderá também promover a expressão myoD, que induz a paragem do ciclo celular. Os nossos resultados de RT-qPCR in vivo demonstram um aumento da expressão do Cdkn1a, aliada a uma deficiência na proliferação, que juntos podem explicar o número reduzido de MuSCs, resultando em menos células miogénicas. Embora a ligação entre LAMA2-CMD e senescência não tenha sido estabelecida, estudos apontam para uma exacerbação da distrofia muscular de Duchenne provocada pela senescência crónica e que a inibição da senescência resultaria em melhorias da doença. Com a expressão aumentada Ccl7 e Il-6ra, seria esperado que ocorresse um aumento da inflamação nos músculos dyW. No entanto, Nunes et al. demonstrou que tanto a inflamação como da fibrose não apareciam aumentadas em E17.5 ou PN2. De um modo geral, a paragem do ciclo celular parece estar aumentada, quer pelo aumento da expressão de Cdkn1a e Cdkn1c, quer pela expressão reduzida do marcador de proliferação Mki67, sendo esta paragem do ciclo celular característica necessária para a ocorrência de outros mecanismos, especialmente a quiescência, senescência e a apoptose. Isto é também suportado pelos dados obtidos in vitro. Embora não houvesse diferença nos genes relacionados com a apoptose, um dos dois genes analisados e relacionado com a senescência – Ccl7 –, apresentava um aumento de expressão. O aumento de expressão de Atg7, gene envolvido na autofagia, pode revelar um esforço das células para manter as necessidades metabólicas e, possivelmente, controlar níveis aumentados de espécies reativas de oxigénio (ROS), característica dos pacientes LAMA2-CMD. Assim, estes dados apontam para a hipótese de que o aumento da autofagia ocorre como oposição ao aumento de ROS, conduzindo assim à diminuição da atividade metabólica e consequente diminuição da proliferação, quer pela entrada em quiescência, quer pela senescência. Embora atualmente não exista cura ou tratamentos eficientes para LAMA2-CMD, diversos estudos com diferentes terapias experimentais encontram-se em curso. Assim, este trabalho permitiu enriquecer o conhecimento sobre como a ausência de Lama2 poderá impactar e alterar os mecanismos envolvidos no destino celular no início da LAMA2-CMD, mais propriamente durante o desenvolvimento fetal do ratinho. Sendo esta a distrofia muscular congénita mais comum, uma melhor compreensão dos mecanismos que desencadeiam o aparecimento desta condição é crucial para desenvolver abordagens terapêuticas que possam prolongar o tempo de vida e aumentar o bem-estar dos pacientes.

Laminin α2 chain-deficient congenital muscular dystrophy (LAMA2-CMD) is caused by recessive mutations in the LAMA2 gene. This neuromuscular disease is diagnosed at birth or within the first few months of life and is characterized by hypotonia and severe muscle weakness. Using the dyW mouse model of LAMA2-CMD, previous studies by the host laboratory showed that the onset of this muscular dystrophy occurs in utero, more specifically between embryonic days 17.5 and 18.5 (E17.5- E18.5), where it is observed a reduction in the size of muscle fibers and lower expression of the myogenic factors Pax7 and Myogenin. These alterations may be related to changes in cell cycle and cell survival regulation, as revealed by the overactivation of the transcription factor STAT3 and increased expression of the respective target gene Pim1. To investigate how Lama2-deficiency impacts on cell cycle regulation and survival, we used RT-qPCR and Western Blot to analyze the expression of genes and proteins involved in different cell fate pathways, comparing epaxial muscles of wildtype (wt) and dyW mice at E17.5 and E18.5. We also generated C2C12 myoblast cell lines deficient for Lama2 and for both Lama2 and p53, a master transcription regulator of cell cycle and survival. Using these in vitro models, pathways linked to proliferation/cell cycle were analyzed by RT-qPCR, immunofluorescence and Resazurin assay. Our results suggest a difference in genes linked to cell cycle regulation, proliferation, autophagy and senescence. C2C12 Lama2 knockouts revealed a decrease in proliferation, possibly explained by cell cycle arrest at G1/G0 phase, which was partially rescued by the co-deletion of Lama2 and p53. This work highlighted alterations in terms of cell fate regulation, involved in LAMA CMD onset, and resulted in the generation of an in vitro model, both important to gain further mechanistic insights about this disorder and to develop efficient therapies.

Tese de Mestrado, Biologia Molecular e Genética, 2022, Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências