Em Portugal são fabricados e comercializados uma vasta gama de queijos tradicionais de elevada riqueza e especificidade, muitos dos quais com Denominação de Origem Protegida (DOP). Estes queijos são ricos em microrganismos e necessitam destes durante o seu fabrico e maturação, o que lhes permite adquirir propriedades sensoriais específicas e características de cada produto e/ou região. O presente estudo analisou queijos tradicionais Portugueses com DOP de duas regiões Azeitão e Nisa que, apesar de serem produzidos em áreas distintas, apresentam semelhanças tais como o uso de leite de ovelha não pasteurizado e coalho vegetal (Cynara cardunculus) e, para tal, foram recolhidas amostras de cinco queijarias da região de Azeitão e duas da região de Nisa em três anos de produção (2016, 2017 e 2018). Desta forma, o objetivo deste estudo foi a caracterização do microbioma autóctone presente nas amostras de queijos Azeitão DOP e Nisa DOP, usando métodos de microbiologia convencional e molecular, incluindo uma abordagem metagenómica. Inicialmente, procedeu-se à análise da diversidade dos perfis microbiológicos totais das diferentes amostras. Extraiu-se DNA das amostras recolhidas nas diferentes queijarias e anos de produção e procedeu-se à técnica de RAPD-PCR com os primers M13 e OPC15. Observou-se que cada amostra possuía um perfil próprio e que havia variações na comunidade microbiana das amostras da mesma queijaria recolhidas em anos diferentes. Posteriormente, de forma a identificar os géneros microbianos predominantes, realizou-se a técnica de sequenciação das regiões V1-V3 do gene 16S rRNA e foi visível que apesar da variedade genética de cada amostra o grupo de bactérias em maior abundância foram as bactérias ácido lácticas sendo os géneros predominantes Lactococcus e Leuconostoc. De forma a caracterizar as bactérias acido láticas presentes nas amostras em análise procedeu-se ao isolamento em meios seletivos e diferenciação dos isolados utilizando as técnicas de RAPD-PCR com o primer OPC15 e eletroforese em campo pulsado com a endonuclease de restrição SmaI. Esta análise permitiu visualizar maior diversidade nos isolados do género Lactococcus em todas as amostras analisadas, comparativamente aos outros dois grupos e ainda que os perfis dos isolados apresentam variações em amostras da mesma queijaria mas de anos de produção distintos, com exceção de isolados do género Enterococcus onde foi visível em certas amostras a dominância de um perfil específico nos anos em estudo. Em conclusão, os resultados deste estudo comprovaram que o microbioma destes queijos tradicionais portugueses é muito complexo e que cada amostra de queijo possui um microbioma autóctone característico e único com elevada relevância. Deste modo, será interessante uma caracterização mais detalhada destes microrganismos relativamente aos seus potenciais tecnológicos e patogénicos.

In Portugal, a wide range of traditional cheeses of high richness and specificity are manufactured carrying out the artisanal ways and without the use of starter cultures, many of them with Protected Designation of Origin (PDO). The autochthonous microbiome of these cheeses is responsible for the fermentation processes required during cheese manufacture and maturation and thus for the organoleptic characteristics of each product or region. The present study analysed two Portuguese traditional PDO cheeses (Azeitão and Nisa), the samples were collected over a three years period (2016, 2017 and 2018) at seven dairies (five from Azeitão and two from Nisa). The aim of this study was characterizing the autochthonous microbiome present in the cheese’s samples, using techniques of conventional and molecular microbiology, as well as a metagenomic approach (sequencing of the V1-V3 region of the 16S RNA). Data from metagenomic approach allowed the identification of Lactococcus and Leuconostoc genus as the most abundant among cheese samples, despite region of origin and year of production. The results showed significant variations on the microbial diversity between dairies, regions and over time. Besides that, we could identify a wide range of lactic acid bacteria as being characteristic of specific dairies or regions. These bacteria belong mainly to the genus Enterococcus and we observed that remained constant over-time, suggesting that these bacteria have an important role in the manufacture of the samples under study. In conclusion, results obtained prove that autochthone microbiome of traditional cheeses with PDO is very complex and dynamic, so they are relevant in the samples, so we need to make further characterization of the microorganisms and analyse their technological or pathogenicity potential.

Tese de mestrado, Microbiologia Aplicada, Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2018