O presente relatório de estágio está integrado no 2º ano do Mestrado em Biotecnologia, da Universidade da Beira Interior. Este decorreu durante oito meses no departamento de Biologia Molecular da empresa multinacional ALS Life Sciences Portugal, S.A., sediada em Tondela. O principal objetivo foi o desenvolvimento e validação de um método de deteção molecular de clostridia, produtores de neurotoxinas botulínicas do tipo A, B, E e F por PCR em tempo real. Clostridium botulinum é uma bactéria anaeróbia que produz neurotoxinas altamente potentes e endósporos resistentes, daí ser uma preocupação mundial a nível da segurança alimentar. Após a sua ingestão, a toxina liga-se aos terminais nervosos colinérgicos onde, devido à sua atividade como endopeptídase, cliva as proteínas responsáveis pela libertação de acetilcolina para a fenda sináptica. Devido a esta ação, a transmissão nervosa fica comprometida. Assim, é crucial haver um diagnóstico rápido com base em metodologias sensíveis e específicas da análise de DNA, para detetar esta bactéria em alimentos. Neste trabalho pretendeu-se, através da aplicação da técnica de PCR em tempo real, fazer a deteção molecular de clostridia produtores de neurotoxinas botulínicas tipo A, B, E e F. Este método apresenta uma evolução comparativamente à técnica de PCR convencional devido a ser mais rápido e sensível. Foram realizados testes para a determinação do limite de deteção, análise de especificidade e contaminação artificial de amostras reais. Para isso utilizaram-se 11 bactérias diferentes e 5 tipos de matrizes alimentares, sugeridas na norma ISO/TS 17919:2013. Os resultados demostraram especificidade de primers e sonda e um limite de deteção de 10 cópias/µL para a toxina A, B e F e um limite de 100 cópias/µL para a toxina E.

his internship report is part of the 2nd year of the Master's degree in Biotechnology, of the University of Beira Interior. It took place during eight months in the Molecular Biology department of the multinational company ALS Life Sciences Portugal, S.A, in Tondela. The main objective was the development and validation of a molecular detection method of clostridia, producers of botulinum neurotoxins type A, B, E and F by PCR. Clostridium botulinum is an anaerobic bacterium that produces highly potent neurotoxins and resistant endospores, making it a global food safety concern. After ingestion, the toxin binds to the cholinergic nerve terminals where, due to its activity as an endopeptidase, it cleaves the proteins responsible for the release of acetylcholine into the synaptic cleft. Due to this action, nerve transmission is compromised. Thus, it is crucial to have a rapid diagnosis based on sensitive and specific DNA analysis methodologies to detect this bacterium in food. This work aims, by applying the real-time PCR technique, to make the molecular detection of clostridia that produce botulinum neurotoxins type A, B, E and F. This method presents an evolution compared to the conventional PCR technique due to being faster and more sensitive. Specificity and artificial contamination tests of real samples were performed. For this, 11 different bacteria and 5 types of food matrices were used, as suggested in ISO/TS 17919:2013. The results showed primer and probe specificity and a detection limit of 10 copies/µL for toxin A, B and F and a limit of 100 copies/µL for toxin E.