ABSTRACT - Relações estrutura-função em novos complexos coesina-doquerina. - As interacções coesina-doquerina são responsáveis pela organização de um complexo multi-enzimático concebido para a degradação de glúcidos complexos da parede celular vegetal e secretado por bactérias anaeróbias, denominado por celulossoma. As doquerinas do tipo I exibem geralmente um modo de ligação dupla, que tem sido apontada como responsável por uma maior flexibilidade no funcionamento do celulossoma. Pelo contrário, a estrutura de doquerinas do tipo II sugere um modelo simples de ligação. Neste trabalho são reportados estudos de estrutura-função nos sistemas celulossomais de Clostridium thermocellum, Bacteroides cellulosolvens e Acetivibrio cellulolyticus. Os resultados mostram que o mecanismo de reconhecimento da celulose - substrato principal do celulosoma, se faz de uma forma muito dinâmica através do fragmento N-terminal do complexo (Capítulo 2). Para compreender o mecanismo de funcionamento de sistemas celulossomais mais elaborados, procederam-se a estudos estruturais em complexos coesina-doquerina do tipo I e II, de B. cellulosolvens e A. cellulolyticus. A estrutura da coesina do tipo I da proteína ScaB do B. cellulosolvens foi determinada (Capítulo 3). Esta coesina mostrou ser topologicamente muito semelhante às do tipo I do C. thermocellum e do C. cellulolyticum e a doquerina por esta reconhecida apresenta um modo de ligação dupla. No Capítulo 4, a estrutura do módulo X-doquerina do tipo II de A. cellulolyticus em complexo com uma coesina do tipo II, presente numa proteína adaptadora, foi resolvida em duas orientações diferentes. O módulo X-doquerina exibe simetria estrutural que se traduz pela presença de duas superfícies de ligação à coesina praticamente idênticas, sugerindo que a flexibilidade impressa nesta doquerina é extensiva a complexos do tipo II. No Capítulo 5, a estrutura do complexo coesina-doquerina do A. cellulolyticus, que é responsável pela ligação do celulossoma à célula, foi resolvida. Típico das interacções coesina-doquerina do tipo I, esta doquerina exibe um modo de ligação dupla, possuindo, no entanto, uma interface de ligação mais extensa do que a observada em outros complexos do tipo I, resultando numa constante de afinidade extremamente elevada (Ka ~ 1012 M). Os dados revelam que os resíduos localizados nas posições 12, 14 e 19 da doquerina regulam a especificidade das interacções coesina-doquerina do tipo I em A. cellulolyticus. Em conclusão, este trabalho reforça a importância do modo de ligação dupla das doquerina para conferir flexibilidade à montagem do celulossoma e também na sua associação à superfície celular.

Cohesin-dockerin interactions orchestrate the assembly of carbohydrate degrading multi-enzyme complexes produced by anaerobic bacteria termed cellulosomes. Type I dockerins typically display a dual binding mode which has been suggested to allow increased flexibility for cellulosome assembly. In contrast, structural work on type II dockerins suggests that they display a single binding mode. In this work structure function studies were developed in the cellulosomal systems of Clostridium thermocellum, Bacteroides cellulosolvens, and Acetivibrio cellulolyticus. The data provides novel structural and dynamic insights into the mechanism of substrate recognition by cellulosomes (Chapter 2). In addition, to understand the mechanism of cellulosome assembly in more elaborate cellulosomal systems, structural studies of novel type I and type II cohesin-dockerin complexes of B. cellulosolvens and A. cellulolyticus were developed. The crystal structure of a type I cohesin from B. cellulosolvens cell surface anchoring scaffoldin ScaB is reported (Chapter 3). This type I cohesin is highly similar to the type I cohesins from C. thermocellum and C. cellulolyticum and its cognate type I dockerin displays a dual binding mode. In Chapter 4, the structure of the type II X-dockerin from A. cellulolyticus in complex with a type II adaptor cohesin in two distinct orientations is described. The dockerin displays structural symmetry which is reflected by the presence of two essentially identical cohesin binding surfaces, suggesting that flexibility modulated by the dockerin dual binding mode is extended to type II complexes. In Chapter 5, the structure of a A. cellulolyticus type I cohesin-dockerin complex involved in cell surface attachment is described. Typical of type I cohesin-dockerin interactions this dockerin displays a dual binding mode, with a complex interface much more extensive than that observed in other type I complexes, resulting in an extremely tight interaction (Ka ~ 1012 M). Furthermore, data reveal that residues located at dockerin positions 12, 14 and 19 modulate the specificity of type I cohesin-dockerin interactions in A. cellulolyticus. In conclusion, this work demonstrates the importance of the dockerin dual binding mode to incorporate additional flexibility to cellulosome assembly and also polycellulosome assembly and cell surface attachment.

Tese de Doutoramento em Ciências Veterinárias - Especialidade de Ciências Biológicas e Biomédicas