Em genética forense, a sequenciação do ADN mitocondrial (ADNmt) pode ser uma ferramenta crucial designadamente sempre que não é possível obter ADN nuclear (ADNn) analisável, a partir das amostras biológicas. Amostras recolhidas em cadáveres em avançado estado de decomposição e cabelos ou pêlos recolhidos em local de crime são exemplos de amostras biológicas a partir das quais a análise do ADNmt pode ser o único meio de prova genético. O ADNmt é vantajoso por existir em maior quantidade do que o ADNn, mas tem a desvantagem de ser um elemento não individualizante, sendo comum a todos os indivíduos da mesma linhagem materna. O Serviço de Genética e Biologia Forenses (SGBF) do Instituto Nacional de Medicina Legal e Ciências Forenses, I.P. (INMLCF), está a implementar a sequenciação massiva em paralelo (MPS), sequenciação de segunda geração. A MPS, relativamente à técnica de sequenciação de Sanger (SS), tem como vantagens, desde logo, permitir sequenciar o genoma mitocondrial completo e oferecer a capacidade de analisar múltiplas amostras biológicas em simultâneo. Com o objetivo de implementar e validar a sequenciação do genoma mitocondrial por MPS foi avaliada a concordância entre as metodologias SS e MPS. Foram selecionadas 64 amostras biológicas, previamente estudadas e analisadas pela metodologia SS. Para o estudo pela metodologia MPS as amostras foram extraídas com PrepFiler Express BTA™ Forensic DNA Extraction Kit e quantificadas com Quantifiler™ Trio DNA Quantification Kit. A preparação de bibliotecas de ADNmt foi feita num equipamento Ion Chef™ com o Precision ID mtDNA Whole Genome Panel e o Precision ID DL8 Kit. Na quantificação das bibliotecas de ADNmt foi utilizado o Ion Library TaqMan™ Quantitation Kit. A preparação do template e carregamento do Ion 530™ Chip foi realizada no Ion Chef™ com os kits Ion S5™ Precision ID Chef & Sequencing Kit. A sequenciação, através da deteção de alterações de pH provocada pela libertação de iões de hidrogénio (H+), ocorridas durante a polimerização do ADN e incorporação de bases, foi realizada num Ion GeneStudio™ S5 System e em conjunto com o sistema Ion Torrent™ que determinou a sequência da molécula em estudo, transformando o sinal químico em sinal digital. A análise e determinação do haplótipo do ADNmt foi realizada com o Converge™ Software. O haplótipo de ADNmt determinado com as metodologias SS e MPS foi coincidente em todas as amostras. Adicionalmente, a metodologia MPS aumentou a eficiência e precisão na análise das amostras de ADNmt. A simplicidade do sistema MPS elimina a necessidade de utilização de nucleotídeos modificados, de lasers, scanners e câmaras de deteção, garantindo exatidão na deteção dos polimorfismos. Este sistema garante ainda uma cobertura homogénea da sequência em estudo, até mesmo em regiões ricas em conteúdo GC e regiões homopoliméricas.