Objetivos: O propósito da investigação é avaliar a possibilidade de contaminação microbiana de cones de guta-percha retirados de uma caixa nova e em caixas em utilização, na clínica Dentária do Instituto Universitário Superior Egas Moniz (IUEM), verificando-se a possibilidade de existência de contaminação dos cones com Enterococcus faecalis após a manipulação dos referidos cones. Materiais e Métodos: Inicialmente foram utilizadas 10 caixas de cones de guta-percha intactas de onde foram extraídos aleatoriamente 3 cones de cada uma delas perfazendo um total de 30 cones. As mesmas caixas foram colocadas em utilização, por um período de 30 dias. Após os 30 dias, as caixas selecionadas inicialmente foram recolhidas e retirados mais 30 cones para posterior análise. Foram, ainda, recolhidos mais 03 cones de uma outra caixa de guta-percha utilizada para reposição de cones, procedimento realizado como protocolo habitual de reposição de guta-percha em caixas que se encontre vazia, na clínica dentária do IUEM. No total foram recolhidos 63 cones de guta-percha retirados de 11 caixas. Resultado: Na investigação das 63 amostras dos cones de guta-percha, observou-se que apenas 3%, isto é, 02 amostras, demonstraram crescimento de micro-organismos, uma em cada fase. No entanto, de acordo com o resultado do teste de catalase, constatou-se que não eram Enterococcus faecalis. Conclusões: A possibilidade da contaminação microbiana de cones de guta-percha, retirados de caixas novas intactas e em cones provenientes de caixas em utilização é muito reduzida. Foi demonstrado que 97% da amostra apresentou estar isento de crescimento de micro-organismo. Dos 3% das amostras que apresentaram crescimento bacteriano retiradas das caixas, o número de colónias encontrado foi inferior quando comparado com o das caixas novas, constatou-se que não eram Enterococcus faecalis. Foi possível concluir existir eficácia no protocolo de prevenção da contaminação cruzada em utilização atual na Clínica do IUEM.