O consumo crescente de compostos farmacêuticos tem levado à libertação de inúmeros compostos não metabolizados para o meio ambiente, sobretudo através de fluidos biológicos, como a urina, ou outros compostos como fezes. Os efluentes resultantes devem ser tratados em Estação de Tratamento de Águas Residuais, porém estas instalações não têm capacidade ou infraestruturas adequadas para a remoção destes compostos. O trimetoprim (TMP) é um agente antimicrobiano e antiparasítico vastamente prescrito/administrado, existindo um elevado consumo por parte da população. Devido à sua alta prevalência em corpos aquáticos, este fármaco é considerado um poluente emergente. Deste modo, tornase imprescindível o desenvolvimento de métodos analíticos inovadores para a análise e deteção de TMP, os quais devem ter características vantajosas comparativamente aos métodos tradicionalmente usados. Os biossensores são uma alternativa atrativa devido à sua rápida resposta, fácil miniaturização e portabilidade. Neste trabalho foi desenvolvido um imunossensor eletroquímico para análise de TMP em amostras alimentares provenientes do meio aquático. Procedeu-se à construção de um sistema eletroquímico que contempla uma célula eletroquímica de tamanho reduzido, um elétrodo de trabalho de papel de fibra de carbono (CP) e um elétrodo de carbono vítreo (GCE) utilizado como elétrodo de referência acoplado ao elétrodo auxiliar. Este sistema permitiu o uso de um volume de eletrólito reduzido relativamente menor comparativamente aos sistemas convencionais. Para a construção do imunossensor, imobilizou-se 10 µL de anticorpo anti-TMP policlonal (concentração de 100 µg/mL), durante 20 minutos. Seguiu-se a adição de TMP à célula eletroquímica (método de adição padrão), sendo efetuada a medição em 5 mL de solução tampão PBS, utilizando como técnica a voltametria de onda quadrada (SWV). As características analíticas do imunoensaio foram avaliadas numa gama de concentrações entre 0,5 µM a 3,5 µM, verificando-se a linearidade entre 1,2 µM e 2,8 µM. Os limites de deteção e quantificação (LOD e LOQ, respetivamente) foram calculados, obtendo-se um LOD de 0,25 µM e um LOQ de 0,84 µM. Após a validação do imunossensor, foram analisadas amostras alimentares de bacalhau. Foi efetuado o estudo de recuperação após fortificação das amostras previamente tratadas de acordo com um procedimento estabelecido para o TMP e obtiveram-se recuperações entre 88 e 113%. O biossensor desenvolvido demonstrou resultados promissores para a análise de TMP em peixes. Apesar de serem necessárias melhorias adicionais, este método demonstra ter potencial para o desenvolvimento de um imunossensor capaz de efetuar a deteção rápida, eficaz e utilizando um sistema de tamanho reduzido comparativamente aos tradicionalmente empregues.