La voie des de Bacillus subtilis régule la synthèse de l'enzyme Δ5-acide gras désaturase (Δ5-Des) liée à la membrane induite par le choc froid. Un composant central de la voie des est le régulateur de réponse, DesR, qui est activé par une kinase associée à la membrane, DesK, en réponse à une diminution de la fluidité lipidique de la membrane. Malgré des études génétiques et biochimiques, les détails spécifiques de l'interaction entre la DesR et l'ADN restent inconnus. Dans cette étude, nous montrons que seule la forme phosphorylée de la protéine DesR est capable de se lier à une région régulatrice immédiatement en amont du promoteur du gène Δ5-Des (Pdes). La phosphorylation du domaine régulateur de la DesR dimérique favorise, de manière coopérative, l'occupation hiérarchique de deux sites adjacents, non identiques, de liaison à l'ADN de la DesR-P, de sorte qu'il y a un déplacement de l'équilibre vers la forme active tétramérique du régulateur de réponse. Par la suite, cette propagation du signal de phosphorylation conduit à l'activation du gène des par le recrutement de l'ARN polymérase en Pdes. Il s'agit du premier exemple disséqué d'un facteur de transcription fonctionnant comme un interrupteur activé par la phosphorylation pour un gène de choc à froid, permettant à la cellule d'optimiser la fluidité des phospholipides membranaires. La voie des de Bacillus subtilis régule la synthèse de l'enzyme Δ5-acide gras désaturase (Δ5-Des) liée à la membrane induite par le choc froid. Un composant central de la voie des est le régulateur de réponse, DesR, qui est activé par une kinase associée à la membrane, DesK, en réponse à une diminution de la fluidité lipidique de la membrane. Malgré des études génétiques et biochimiques, les détails spécifiques de l'interaction entre la DesR et l'ADN restent inconnus. Dans cette étude, nous montrons que seule la forme phosphorylée de la protéine DesR est capable de se lier à une région régulatrice immédiatement en amont du promoteur du gène Δ5-Des (Pdes). La phosphorylation du domaine régulateur de la DesR dimérique favorise, de manière coopérative, l'occupation hiérarchique de deux sites adjacents, non identiques, de liaison à l'ADN de la DesR-P, de sorte qu'il y a un déplacement de l'équilibre vers la forme active tétramérique du régulateur de réponse. Par la suite, cette propagation du signal de phosphorylation conduit à l'activation du gène des par le recrutement de l'ARN polymérase en Pdes. Il s'agit du premier exemple disséqué d'un facteur de transcription fonctionnant comme un interrupteur activé par la phosphorylation pour un gène de choc à froid, permettant à la cellule d'optimiser la fluidité des phospholipides membranaires. Tous les organismes doivent communiquer avec leur environnement pour survivre. Les cellules bactériennes surveillent les conditions externes et traitent ces informations pour donner la réponse la plus appropriée. Les systèmes de réglementation à deux composantes sont apparus comme un paradigme pour les réponses adaptatives. Dans sa forme la plus simple, un système à deux composants contient un capteur (histidine kinase) et un régulateur de réponse (souvent un activateur de transcription) (1Hoch J.A. Curr. Opin. Microbiol. 2000 ; 3: 165-170Crossref PubMed Scopus (632) Google Scholar). Les changements dans l'environnement entraînent une phosphorylation du capteur suivie d'une transphosphorylation sur le régulateur de réponse (1Hoch J.A. Curr. Opin. Microbiol. 2000 ; 3: 165-170Crossref PubMed Scopus (632) Google Scholar, 2Fabret C. Feher V.A. Hoch J.A. J. Bacteriol. 1999 ; 181: 1975-1983Crossref PubMed Google Scholar). Bien que des paires de régulateurs de la réponse aux kinases de ce type aient souvent été signalées comme des régulateurs d'une grande variété de voies en réponse à une myriade de signaux (3Bourret R. Borkovich K. Simon M. Annu. Rev. Biochem. 1991 ; 60: 401-441Crossref PubMed Scopus (390) Google Scholar, 4Stock J. Surette M. Levit M. Park P. Hoch J. Silhavy T. Two Component Signal Transduction. American Society for Microbiology, Washington, D. C.1995: 25-51Google Scholar, 5Stock A. Robinson V. Goudreau P. Annu. Biochem. 2000 ; 69: 183-215Crossref PubMed Scopus (2431) Google Scholar), l'exigence de ce système pour contrôler l'expression des gènes pendant le choc à froid n'a été découverte que récemment chez Bacillus subtilis (6Aguilar P.S. Hernandez-Arriaga A.M. Cybulski L.E. Erazo A.C. de Mendoza D. EMBO J. 2001 ; 20: 1681-1691Crossref PubMed Scopus (304) Google Scholar) et les cyanobactéries (7Suzuki I. Los D.A. Kanesaki Y. Mikami K. Murata N. EMBO J. 2000 ; 19: 1327-1334Crossref PubMed Scopus (219) Google Scholar). Le choc froid est une condition de stress qui affecte négativement la croissance des organismes poikilothermiques, tels que les bactéries et les plantes. Ainsi, la compréhension des mécanismes par lesquels ces organismes perçoivent les signaux de basse température et transmettent ces informations à la machinerie cellulaire pour activer les réponses adaptatives est d'une importance fondamentale pour la biologie. Les bactéries et la plupart des organismes poikilothermiques (sinon tous) doivent remodeler la composition lipidique de la membrane pour survivre à basse température. B. subtilis (6Aguilar P.S. Hernandez-Arriaga A.M. Cybulski L.E. Erazo A.C. de Mendoza D. EMBO J. 2001 ; 20: 1681-1691Crossref PubMed Scopus (304) Google Scholar) et Synechocystis (7Suzuki I. Los D.A. Kanesaki Y. Mikami K. Murata N. EMBO J. 2000 ; 19: 1327-1334Crossref PubMed Scopus (219) Google Scholar) répondent à une diminution de la température ambiante de croissance en introduisant des doubles liaisons dans les chaînes acyles de leurs phospholipides membranaires par des acyl lipides désaturases membranaires. Cette modification post-synthétique des chaînes acyles saturées semble être conçue pour améliorer l'effet des changements de température sur l'état physique des phospholipides membranaires. Dans Synechocystis, il a été constaté que l'inactivation de deux histidine kinases modère l'induction à basse température des gènes codant pour Δ6 et ω-3 désaturase (7Suzuki I. Los D.A. Kanesaki Y. Mikami K. Murata N. EMBO J. 2000 ; 19: 1327-1334Crossref PubMed Scopus (219) Google Scholar). Cependant, les régulateurs transcriptionnels de ces gènes n'ont pas encore été identifiés. Un exemple mieux compris de perception et de transduction de signaux de basse température est la voie Des de B. subtilis, qui régule l'expression de l'acyl lipide désaturase, Δ5-Des. Cette voie répond à une diminution de la température de croissance en améliorant l'expression du gène des codant pour Δ5-Des (8Aguilar P.S. Cronan Jr., J.E. de Mendoza D. J. Bacteriol. 1998 ; 180: 2194-2200Crossref PubMed Google Scholar, 9Aguilar P.S. Lopez P. de Mendoza D. J. Bacteriol. 1999 ; 181: 7028-7033Crossref PubMed Google Scholar, 10Díaz A. Mansilla M.C. Vila A. de Mendoza D. J. Biol. Chem. 2002 ; 277: 48099-48106Abstract Full Text PDF PubMed Scopus (58) Google Scholar, 11Altabe S. Aguilar P. Caballero G. de Mendoza D. J. Bacteriol. 2003 ; 185: 3228-3231Crossref PubMed Scopus (66) Google Scholar). La voie des est contrôlée de manière unique et rigoureuse par le système à deux composants, DesK/DesR (6Aguilar P.S. Hernandez-Arriaga A.M. Cybulski L.E. Erazo A.C. de Mendoza D. EMBO J. 2001 ; 20: 1681-1691Crossref PubMed Scopus (304) Google Scholar). La DesK est une histidine kinase située dans la membrane et la DesR est un régulateur de la réponse cytoplasmique de 22,18kDa qui se lie spécifiquement à la région promotrice qu'elle contrôle. Les régulateurs de réponse ont été classés en fonction des similitudes dans le domaine de liaison à l'ADN. DesR appartient au groupe NarL, dans lequel le domaine de liaison C-terminal contient un motif hélice-tour-hélice (2Fabret C. Feher V.A. Hoch J.A. J. Bacteriol. 1999 ; 181: 1975-1983Crossref PubMed Google Scholar). Sur la base du paradigme du système à deux composants et de travaux antérieurs, nous avons proposé que les deux protéines communiquent via une série de réactions de phosphorylation et de phosphotransfert. DesK détecte une diminution de la fluidité lipidique membranaire et est autophosphorylée par l'ATP intracellulaire à His-188 (12Cybulski L. Albanesi D. Mansilla M.C. Altabe S. de Mendoza D. Mol. Microbiol. 2002 ; 45: 1379-1388Crossref PubMed Scopus (98) Google Scholar, 13Albanesi D. Mansilla M.C. de Mendoza D. J. Bacteriol. 2004 ; 186: 2655-2663Crossref PubMed Scopus (84) Google Scholar). Nous avons récemment démontré que DesK-P est capable de phosphoryler DesR (13Albanesi D. Mansilla M.C. de Mendoza D. J. Bacteriol. 2004 ; 186: 2655-2663Crossref PubMed Scopus (84) Google Scholar) nous avons donc suggéré que cette modification covalente de DesR permet son interaction avec la région régulatrice des, conduisant à l'activation de la transcription des. Cette hypothèse était basée sur le fait qu'aucun régulateur de réponse bactérienne n'a encore été trouvé actif sous la forme non phosphorylée, bien que certains régulateurs de réponse, tels que la levure SSK1 I, soient inactifs sous la forme phosphorylée (14Posas F. Saito H. EMBO J. 1998 ; 17: 1385-1394Crossref PubMed Scopus (249) Google Scholar). Bien que des études génétiques aient montré que le DesR est absolument nécessaire à l'expression du des, on ne sait pas si le DesR est capable de stimuler la transcription en soi ou s'il est nécessaire de stimuler la synthèse ou l'activité d'un autre facteur nécessaire à la transcription du des. Dans la présente étude, nous avons examiné comment la phosphorylation influence la capacité de DesR à se lier au promoteur des (Pdes). 1Les abréviations utilisées sont : Pdes, promoteur des ; RNAP, ARN polymérase ; EMSA, test de déplacement de mobilité électrophorétique ; Ac-P, phosphate d'acétyle ; CI et CII, complexes I et II ; RA et RB, régions A et B ; DR, répétition directe. 1Les abréviations utilisées sont : Pdes, promoteur des ; RNAP, ARN polymérase ; EMSA, test de déplacement de mobilité électrophorétique ; Ac-P, phosphate d'acétyle ; CI et CII, complexes I et II ; RA et RB, régions A et B ; DR, répétition directe. Nos résultats montrent que seule la forme phosphorylée de DesR, DesR-P, est capable de se lier à la région régulatrice qu'elle contrôle. De plus, nous démontrons que DesR est un dimère en solution qui tend à se tétramériser lors de la phosphorylation, ce qui pourrait expliquer l'interaction coopérative entre les molécules de DesR-P liées aux sites de liaison régulateurs adjacents de DesR aux Pdes. Nous montrons que DesR-P active la transcription des par le recrutement de l'ARN polymérase (RNAP) au promoteur des. Un modèle de reconnaissance du promoteur DesR-P a émergé de nos résultats que nous discutons dans le contexte de la régulation transcriptionnelle de l'homéostasie de la fluidité membranaire. Souches bactériennes, plasmides et constructions de souches - Les souches bactériennes utilisées dans ce travail sont énumérées dans le tableau I des matériaux supplémentaires. La β-Galactosidase a été testée comme décrit précédemment (15Mansilla C. de Mendoza D. J. Bacteriol. 1997 ; 179: 76-981Crossref Google Scholar). Pour muter la répétition inversée IR-L des régions qui ont été protégées dans les expériences d'empreinte (Fig. 4), les oligonucléotides I, II, III et IV ont été utilisés pour l'amplification de deux PCR d'extension de chevauchement (voir le tableau II des matériaux supplémentaires). Un mélange de ces produits de PCR a été utilisé comme matrice d'ADN pour une autre PCR en utilisant les oligonucléotides I et VII (16Horton R. Hunt H. Ho S. Pullen J. Pease L. Gene (Amst.). 1989 ; 77: 61-68Crossref PubMed Scopus (2634) Google Scholar). Le produit d'amplification de 301 pb a été cloné dans le vecteur intégrateur pJM116 (17Dartois V. Dérbarbouillé F. Kunst F. Rapaport G.J. Bacteriol. 1998 ; 180: 1855-1861Crossref PubMed Google Scholar) pour générer pLC118. Pour muter IR-R, les oligonucléotides V et VI ont été utilisés à la place de II et III, et le plasmide résultant était pLC119. Ces plasmides ont été introduits dans le locus amyE de la souche JH642 donnant respectivement les souches LC118 et LC119. La même stratégie a été utilisée pour muter le site de phosphorylation putatif Asp-54 avec Ala, en utilisant les oligonucléotides VIII, IX, X et XI. Le produit d'amplification a été cloné dans le plasmide pGS791 2G. Schujman, communication personnelle. sous le promoteur du xylose, donnant le plasmide pLC90. Ce plasmide a été intégré ectopiquement dans le locus thrC d'une souche de B. subtilis dépourvue de DesR et contenant une fusion du gène rapporteur lacZ au promoteur des (AKP9, voir Réf. 6Aguilar P.S. Hernandez-Arriaga A.M. Cybulski L.E. Erazo A.C. de Mendoza D. EMBO J. 2001 ; 20: 1681-1691Crossref PubMed Scopus (304) Google Scholar) donnant la souche LC90. Le desR de type sauvage a été amplifié à l'aide des oligonucléotides VIII et XI, et a été cloné de la même manière que le desRD54A, donnant la souche LC89. Tous les plasmides ont été séquencés pour confirmer l'introduction de mutations. Gel Mobility Shift Assays - Des fragments d'ADN comprenant le type sauvage ou différents variants du promoteur des ont été préparés par PCR à l'aide des amorces XIII(PECO895) et VII(BAMO) (Matériaux supplémentaires Tableau II). Le test a été effectué comme décrit précédemment (6Aguilar P.S. HERNANDEZ-ARRIAGA A.M. Cybulski L.E. Erazo A.C. de Mendoza D. EMBO J. 2001 ; 20: 1681-1691Crossref PubMed Scopus (304) Google Scholar). Lorsque la DesR phosphorylée a été utilisée dans la réaction, la DesR de 6 μm a été incubée pendant 20 min à 0 °C dans un mélange contenant 50 mm de Tris-HCl, pH 8, 5 mm de MgCl2, 0,5 mm d'EDTA, 1,25 mm de dithiothréitol, 10 % de glycérol et 50 mm d'acétylphosphate. Pour la formation du complexe ternaire, le fragment d'ADN a été préparé en utilisant les amorces XIV et XV (Supplementary Materials Table II). L'holoenzyme RNAP (épicentre) a été ajoutée à 100 nm et incubée 30 min à 25 °C avant d'exécuter le gel. Lorsque l'héparine a été incluse dans la réaction, elle a été ajoutée pendant 5 min, à 60 μg/ml, après l'incubation avec le RNAP. OH•Footprinting Assays—Hydroxyl radical treatment was performed essentially as described (18del Solar G.H. Pérez-Martin J. Espinosa M. J. Biol. Chem. 1990 ; 265: 12569-12575Abstract Full Text PDF PubMed Google Scholar). Un mélange réactionnel typique contenait 2,6 nm de fragment d'ADN marqué en 5′ s'étendant de –167 à +10 par rapport au site de début de transcription des, DesR-P (300 ou 1000 nm), 25 mm de Tris-HCl, pH 8, 1 mm de dithiothréitol, 0,25 mm d'EDTA, 4 mm de MgCl2 et 200 ng de poly(dI-dC). Après 30 min d'incubation à température ambiante, 1 mm d'ascorbate de sodium, H2O2 à 0,03% et Fe(EDTA)2– (concentrations finales de 18 et 36 μm pour Fe(II) et Na2EDTA, respectivement) ont été ajoutés, et l'incubation a été poursuivie pendant 1 min à la même température. Les réactions ont été arrêtées par l'ajout d'une solution thiourée/EDTA (concentrations finales de 9,5 mm de thiourée et 1,7 mm d'EDTA). Les mélanges ont été exécutés dans un gel de polyacrylamide non dénaturant à 5 %. Le gel a été exposé à un film autoradiographique pendant 5 min, et les complexes I et II ont été découpés dans le gel. L'ADN a été élué, précipité, chargé sur des gels de séquençage de polyacrylamide dénaturants à 8%, et s'écoule avec les produits des réactions de séquençage de Maxam et Gilbert (G + A) obtenus à partir du même ADN marqué. Le motif de bande a été visualisé à l'aide d'un Fuji Film Phosphorimager. La séparation du DesR du DesR-P—DesR ou du DesR phosphorylé in vitro avec du phosphate d'acétyle (Ac-P) pendant 20 min a été injectée sur une colonne Vydac en phase inversée C4, à l'aide d'un chromatographe liquide ÄKTA. L'éluant A était 0,1% d'acide trifluoroacétique, 20% d'acétonitrile dans l'eau ; l'éluant B était 0,1% d'acide trifluoroacétique, 60% d'acétonitrile dans l'eau. L'échantillon a été élué avec un gradient qui variait de 80 à 0% A, sur 40 min. L'éluant B a commencé à 20 % et est passé à 100 % sur le même intervalle. Le débit était de 1 ml/min. Ultracentrifugation analytique - Des études d'ultracentrifugation analytique ont été réalisées dans un Beckman XL-A (Beckman Instruments Inc.) équipé d'un système optique UV-visible à l'intérieur de la microcentrifugeuse. Des expériences d'équilibre de sédimentation ont été réalisées à 12 000 tr/min et 20 °C dans des centres à huit canaux Epon avec des concentrations de charge protéique comprises entre 1 et 12 μm. DesR a été équilibré dans un tampon contenant 50 mm de Tris-HCl, pH 8, 5 mm de MgCl2, 0,5 mm d'EDTA, 0,1 mm de dithiothréitol (et 50 mm d'Ac-P lorsque cela est indiqué). Des balayages d'absorption radiale à 231, 275 et 280 nm ont été effectués après que l'équilibre de sédimentation ait été atteint. Les décalages de base ont été déterminés par centrifugation à grande vitesse (42 000 tr/min). Les données expérimentales ont été analysées à l'aide du programme Sednterp version 1.03 XLAEQ et EQASSOC (Beckman ; 19Laue T.M. Shah B.D. Ridgeway T.M. Pelletier S.L. Harding S.E. Rowe A.J. Horton J.C. Analytical Ultracentrifugation in Biochemistry and Polymer Science. Royal Society of Chemistry, Cambridge1992: 90-125Google Scholar, 20Minton A.P. Schuster T.M. Laue T.M. Modern Analytical Ultracentrifugation. Birkhauser, Boston, MA1994: 81-93Crossref Google Scholar), en utilisant un volume spécifique partiel pour DesR de 0,7449 ml g–1. Cette valeur a été déterminée sur la base de sa composition en résidus d'acides aminés. Les valeurs des coefficients d'extinction à 280 nm ont été calculées à partir des teneurs connues en tryptophane et en résidus de tyrosine. Détermination du poids moléculaire de DesR par diffusion de la lumière statique - Le poids moléculaire moyen (MR) de DesR de type sauvage et de son mutant DesRD54A traité et non traité avec Ac-P a été déterminé sur un instrument de diffusion de la lumière de détecteur de précision PD2010 connecté en tandem à un système de chromatographie liquide haute performance et à un réfractomètre différentiel LKB 2142. Les échantillons ont été chargés sur une colonne Sephadex G-25 (1 ml) et élués avec du Tris-HCl 50 mm, pH 8, du NaCl 0,3 m, du dithiothréitol 0,5 mm, à un débit de 0,3 ml/min. Les signaux de diffusion de la lumière à 90° et d'indice de réfraction du matériau d'élution ont été enregistrés sur un ordinateur PC et analysés avec le logiciel Discovery32 fourni par Precision Detectors. Le détecteur de diffusion de la lumière à 90° a été étalonné en utilisant l'albumine sérique bovine (66,5 kDa) comme étalon. Tests de transcription in vitro Des réactions de transcription in vitro (50 μl) ont été effectuées dans un tampon contenant 40 mm de Tris-HCl, pH 8, 10 nm de MgCl2, 150 mm de KCl, 0,1 mm d'EDTA et 5 % de glycérol. Un fragment d'ADN s'étendant de la position –177 à la position +43 a été préparé par PCR en utilisant les oligonucléotides PA et PC (Tableau Supplémentaire II). L'ADN (5 nm) a d'abord été incubé avec du DesR-P (300 nm) pendant 20 min à 25 °C, puis 10 min avec du RNAP (0,2 unités) à la même température. Le mélange a ensuite été traité avec 10 μg/ml d'héparine pendant 3 min à 37 °C. Les réactions ont été déclenchées par l'ajout de 5 μl d'une solution de 2 m des quatre NTP contenant 0,5 μm [α-32P]UTP (400 Ci/mmol ; 10 μCi/μl). Après 5 min d'incubation à 37 °C, la réaction a été terminée par l'addition d'acétate de sodium, pH 7, à 300 mm, d'EDTA à 15 mm, et d'ARNt à 100 μg/μl, et les acides nucléiques ont été précipités par l'addition de 250 μl d'éthanol à 100%. Les produits ont été fractionnés par électrophorèse sur des gels de polyacrylamide à 8% contenant 8 m d'urée. Équation pour calculer la constante de dissociation relative des complexes régulateur-ADN I et II—KdI et KdII représentent les constantes de dissociation pour les complexes spécifiques I et II, respectivement. fmaxCI représente le niveau maximal fractionnaire du complexe I atteint dans les réactions (21Tsai S. Tsai M. O'Malley B. Cell. 1989 ; 57: 443-448Abstract Full Text PDF PubMed Scopus (194) Google Scholar). ADN+DesR⇄KdICI⇄KdII↘DesRCII(Eq. 1) KdIKdII=[1fmaxCI−1]2(Eq. 2) La phosphorylation de DesR augmente l'affinité de liaison à son ADN cible - Nous avons souhaité examiner comment la phosphorylation influence la capacité de DesR à se lier à une région d'ADN couvrant Pdes par des tests de déplacement de mobilité électrophorétique (EMSA) en utilisant DesR ou DesR-P, ce dernier phosphorylé in vitro avec Ac-P. À cette fin, un fragment d'ADN de 216 pb marqué par PCR [α-32P] dATP s'étendant des positions –187 à +29, par rapport au site de début de transcription des, a été incubé avec des protéines DesR ou DesR-P purifiées. Les résultats ont montré que Pdes présentait des changements dans sa mobilité électrophorétique en présence de l'un ou l'autre des DesR (Fig. 1A) ou DesR-P (Fig. 1B) ; cependant, lorsque DesR-P était utilisé, des concentrations protéiques plus faibles étaient suffisantes pour obtenir la même fraction d'ADN complexé. La DesR phosphorylée a montré une liaison au promoteur des à des concentrations aussi faibles que 0,06 μm. À cette concentration, un complexe I (CI) à migration rapide a été principalement observé. L'augmentation de la concentration de DesR-P a augmenté progressivement la formation du complexe II à migration lente (CII ; Fig. 1B). À 0,6 μm, la CII est clairement le complexe protéine-ADN prédominant. La formation de deux complexes différents, CI et CII, nous a suggéré l'existence de deux sites de liaison pour le régulateur de réponse. La DesR sans traitement Ac-P était également capable de se lier aux Pdes, mais des concentrations plus élevées étaient nécessaires pour former l'IC et la CII (Fig. 1A). Le site de phosphorylation de DesR est Asp-54 - L'analyse comparative des séquences des régulateurs de la réponse bactérienne utilisant l'alignement de séquences multiples avec le regroupement hiérarchique (Multalin) a indiqué que Asp-54 de DesR devrait être le résidu qui reçoit le groupe phosphoryle de la kinase apparentée, DesK. Pour déterminer si ce site de phosphorylation présumé, Asp-54, était impliqué dans l'activité de DesR, il a été substitué par Ala par mutagenèse dirigée. Des fragments d'ADN portant soit desR + (type sauvage) soit desR codant pour la protéine mutante (desRD54A) ont été fournis en trans dans un mutant nul desR portant une fusion du gène rapporteur lacZ au promoteur des. L'expression de desR + de type sauvage permettait de stimuler la transcription des lors d'un rétrogradage de température, alors que l'expression de desRD54A ne pouvait pas stimuler la transcription de la fusion des-lacZ dans les mêmes conditions (Matériaux Supplémentaires Fig. S1), indiquant que le résidu Asp-54 est crucial pour l'activité transcriptionnelle DesR in vivo. Confirmant cette conclusion, nous avons déterminé que la DesK autophosphorylée sert de phosphodonateur de la protéine effectrice DesR, mais ne peut pas transférer le groupe phosphoryle à DesRD54A (données non présentées). La forme non phosphorylée de DesR est incapable de se lier au promoteur des - Certains régulateurs de réponse tels que B. subtilis PhoP se lient à ses promoteurs cibles soit sous la forme non phosphorylée soit sous la forme phosphorylée. Cependant, la forme non phosphorylée de PhoP est incapable d'activer la transcription (22Liu W. Hulett M. J. Bacteriol. 1997 ; 179: 6302-6310Crossref PubMed Google Scholar). Comme le montre la Fig. 1A, DesR se lie à Pdes même sans traitement préalable avec Ac-P, bien que des expériences in vivo (décrites dans les matériaux supplémentaires Fig. S1) a indiqué que la phosphorylation de l'Asp-54 est cruciale pour l'activité de la DesR. Cela suggérait que DesR se comportait de la même manière que PhoP. Si tel était le cas, DesRD54A devrait se lier à Pdes dans l'EMSA, de la même manière que DesR non phosphorylé, mais le traitement de DesRD54A avec Ac-P ne devrait pas augmenter son affinité de liaison. Pour évaluer cette possibilité, la liaison de DesRD54A purifié aux Pdes a été testée à l'aide de l'EMSA. Étonnamment, DesRD54A était incapable de se lier aux Pdes à n'importe quelle concentration testée, même lorsqu'il était traité avec Ac-P (Matériaux supplémentaires Fig. S2A). Ce résultat pourrait être attribué à : (i) la forme non phosphorylée de DesR ne se lie pas à Pdes, et l'activité de liaison observée dans l'expérience montrée à la Fig. 1A était due à une phosphorylation non spécifique de DesR lors de sa surproduction chez Escherichia coli, ou (ii) la mutation ponctuelle Asp-Ala chez DesRD54A a provoqué un changement de conformation qui a aboli la liaison du régulateur de réponse muté aux Pdes. Pour distinguer ces deux possibilités, DesR purifié à partir d'E. coli a été soumis à une chromatographie liquide haute performance en phase inverse (Matériaux supplémentaires Fig. DesR a montré deux pics qui correspondent à la forme phosphorylée et non phosphorylée du régulateur. Lorsque la DesR extraite d'E. coli a été incubée avec de l'Ac-P, le pic correspondant à la DesR-P a considérablement augmenté (Matériaux supplémentaires Fig. S2C). Ce résultat indique qu'environ 50 % de la DesR marquée par His purifiée à partir d'E. coli est phosphorylée, et que cette forme pourrait être responsable de l'activité de liaison de la DesR sans traitement Ac-P dans les dosages EMSA montrés à la Fig. 1A. Il convient de mentionner que l'analyse du dichroïsme circulaire a montré que DesRD54A présente la même structure secondaire globale que DesR de type sauvage (Matériaux supplémentaires Fig. S2D), soutenant la conclusion que ce régulateur mutant ne se lie pas aux Pdes parce qu'il est incapable d'être phosphorylé dans l'aspartate conservé par Ac-P, plutôt que par un changement structurel produit par la mutation. Pour démontrer directement que la forme non phosphorylée de DesR ne se lie pas à son promoteur cible, nous avons profité de l'observation que DesR-P est complètement déphosphorylée après incubation à 25 °C pendant 12 h (13Albanesi D. Mansilla M.C. de Mendoza D.J. Bacteriol. 2004 ; 186: 2655-2663Crossref PubMed Scopus (84) Google Scholar). Nous avons testé par EMSA le retardement des Pdes en présence de DesR non traité (tel qu'il élue de la colonne nickel-acide nitrilotriacétique), de DesR déphosphorylé par incubation à 25 °C pendant 12 h, ou de DesR déphosphorylé à 25 °C et phosphorylé à nouveau par traitement avec Ac-P. Fig. 2A montre que le DesR non traité forme deux complexes (voies 2–4), alors que le DesR déphosphorylé à 25 °C est incapable de se lier aux Pdes (voies 5–7). Comme prévu, lorsque ce DesR non phosphorylé a été incubé avec Ac-P, il a récupéré l'activité de liaison à l'ADN (voies 8–10). Désormais, nous appellerons « DesR non phosphorylée » la protéine qui a été incubée 12h à 25°C. De plus, l'incubation de DesR non phosphorylés avec des concentrations croissantes d'Ac-P a entraîné une augmentation similaire de la liaison du régulateur de réponse, atteignant un maximum à 50 mm du donneur de phosphoryle (Fig. 2B). À partir des résultats ci-dessus, nous pouvons tirer deux conclusions : (i) l'étendue de la phosphorylation de DesR détermine sa capacité de liaison, et (ii) DesR non phosphorylée est incapable de se lier à son promoteur cible. Il convient de mentionner que lorsque DesRD54A a été incubé avec 50 mm d'Ac-P, puis soumis à une chromatographie liquide à haute performance, nous avons détecté qu'un ou plusieurs sites secondaires de la protéine étaient phosphorylés (données non présentées). Néanmoins, comme le montre la figure Matériaux supplémentaires S2A, la phosphorylation de ce site secondaire n'a pas pu stimuler la liaison de DesRD54A aux Pdes. DesR est un dimère en solution et tétramérise lors de la phosphorylation. La phosphorylation favorise la formation de dimères ou même d'oligomères de nombreux régulateurs de réponse ; cependant, d'autres régulateurs de réponse ne changent pas leur état d'association lors de la phosphorylation (23Jeon Y. Lee Y. Han J. Kim J. Hwang D. J. Biol. Chem. 2001 ; 276: 40873-40879Abstract Full Text PDF PubMed Scopus (74) Google Scholar, 24 Lewis R. Scott D. Brannigan J. Ladds J. Cervin M. Spiegelman G. Hogget J. Barák I. Wilkinson A. J. Mol. Biol. 2002 ; 316: 235-245Crossref PubMed Scopus (1) Google Scholar, 25Wyman C. Rombel I. North A. Bustamente C. Kustu S. Science. 2000 ; 275: 1658-1661Crossref Scopus (209) Google Scholar, 26Da Re S. Schumacher J. Rousseau P. Fourment J. Ebel C. Kahn D. Mol. Microbiol. 1999 ; 34: 504-511Crossref PubMed Scopus (89) Google Scholar). L'existence de deux complexes DesR-P·ADN (Figures 1 et 2) indique que la phosphorylation de DesR favorise la liaison de plus d'une sous-unité de la protéine au promoteur des. Pour étudier l'état d'association du DesR ou du DesR-P, nous avons réalisé des expériences d'équilibre de sédimentation par ultracentrifugation analytique. Dans le cas de DesR-P, il a été nécessaire de définir les conditions expérimentales requises pour stabiliser la forme phosphorylée au cours de l'essai de sédimentation. Parce que la demi-vie de DesR-P à 25 °C est d'environ 90 min (13Albanesi D. Mansilla M.C. de Mendoza D. J. Bacteriol. 2004 ; 186: 2655-2663Crossref PubMed Scopus (84) Google Scholar), un état stable élevé de phosphorylation a été maintenu in situ par l'inclusion d'un excès d'Ac-P dans l'échantillon soumis à l'ultracentrifugation analytique. Des cycles d'ultracentrifugation ont été effectués soit avec du DesR non phosphorylé, soit avec du DesR-P à des concentrations comprises entre 1 et 12 μm. Le DesR non phosphorylé s'est comporté comme un dimère en solution à chaque concentration testée, car toutes les données expérimentales correspondent à la courbe prédite par Sednterp pour un dimère (Matériaux supplémentaires Fig. S3A). Lorsque DesR a été soumis à une ultracentrifugation analytique en présence d'Ac-P, son comportement hydrodynamique a considérablement changé, en particulier à la concentration protéique la plus élevée, à laquelle le tétramère est devenu l'espèce la plus abondante (Matériaux supplémentaires Fig. S3B), bien que le meilleur ajustement comprenne des constantes pour les multimères d'ordre supérieur. Cela suggère que la phosphorylation de DesR favorise une nouvelle interaction entre les dimères de DesR. Les graphiques de la masse moléculaire flottante en fonction de la concentration en protéines (1–12 μm) ont indiqué qu'à de faibles concentrations en protéines, la masse moléculaire de DesR-P correspondait à un dimère (matériaux supplémentaires Fig. S3C). À mesure que les niveaux de DesR-P augmentaient, la masse de l'espèce devenait plus grande, atteignant la masse d'un tétramère. Il s'agit d'un comportement caractéristique d'un système en équilibre ; sinon, la dilution n'affecterait pas la masse moléculaire moyenne de l'espèce. Pour confirmer les propriétés hydrodynamiques de DesR obtenues par ultracentrifugation analytique et pour étudier le phénomène de tétramérisation en l'absence de phosphorylation continue par Ac-P, nous avons recours à des expériences de diffusion de lumière statique. À cette fin, des solutions de DesR ou de DesR non phosphorylées incubées avec de l'Ac-P ont été dialysées pendant 20 min pour éliminer l'agent phosphorylant. Ensuite, l'intensité totale diffusée à 90° a été examinée. Le poids moléculaire moyen de DesR était de 41 553 et celui de DesR-P était de 71 834, correspondant respectivement à 1,94 et 3,36 unités de DesR. Ce dernier nombre fractionnaire suggère que dans cette condition, la phosphorylation avec Ac-P n'atteint pas l'achèvement, et qu'environ 70% de DesR était phosphorylé sur cet échantillon. Les expériences de contrôle avec DesRD54A ont montré un poids moléculaire moyen correspondant à un dimère quel que soit le traitement Ac-P. Prises ensemble, ces expériences ont démontré que DesR est un dimère en solution qui forme principalement des tétramères lors de la phosphorylation. Les tests d'empreinte de la DNase I à haute résolution des contacts de DesR sur sa cible précédente ont montré que DesR se lie à une séquence d'ADN qui s'étend des positions –28 à –77 par rapport au site de début de transcription des, générant 5 régions protégées sur chaque brin (6Aguilar P.S. Hernandez-Arriaga A.M. Cybulski L.E. Erazo A.C. de Mendoza D. EMBO J. 2001 ; 20: 1681-1691Crossref PubMed Scopus (304) Google Scholar). Deux répétitions inversées (5′-TCAT-3′) séparées par 9 nucléotides ont été trouvées au centre de la région protégée. Pour obtenir un profil haute résolution des contacts entre DesR-P et son ADN cible, nous avons eu recours à

La vía des de Bacillus subtilis regula la síntesis de la enzima unida a la membrana inducida por choque frío Δ5-ácido graso desaturasa (Δ5-Des). Un componente central de la vía des es el regulador de la respuesta, DesR, que es activado por una quinasa asociada a la membrana, DesK, en respuesta a una disminución en la fluidez de los lípidos de la membrana. A pesar de los estudios genéticos y bioquímicos, se desconocen detalles específicos de la interacción entre DesR y el ADN. En este estudio mostramos que solo la forma fosforilada de la proteína DesR es capaz de unirse a una región reguladora inmediatamente aguas arriba del promotor del gen Δ5-Des (Pdes). La fosforilación del dominio regulador de DesR dimérico promueve, de manera cooperativa, la ocupación jerárquica de dos sitios de unión al ADN de DesR-P adyacentes, no idénticos, de modo que hay un cambio en el equilibrio hacia la forma activa tetramérica del regulador de respuesta. Posteriormente, esta propagación de la señal de fosforilación conduce a la activación del gen des a través del reclutamiento de ARN polimerasa a Pdes. Este es el primer ejemplo diseccionado de un factor de transcripción que funciona como un interruptor activado por fosforilación para un gen de choque frío, lo que permite a la célula optimizar la fluidez de los fosfolípidos de membrana. La vía des de Bacillus subtilis regula la síntesis de la enzima unida a la membrana inducida por choque frío Δ5-ácido graso desaturasa (Δ5-Des). Un componente central de la vía des es el regulador de la respuesta, DesR, que es activado por una quinasa asociada a la membrana, DesK, en respuesta a una disminución en la fluidez de los lípidos de la membrana. A pesar de los estudios genéticos y bioquímicos, se desconocen detalles específicos de la interacción entre DesR y el ADN. En este estudio mostramos que solo la forma fosforilada de la proteína DesR es capaz de unirse a una región reguladora inmediatamente aguas arriba del promotor del gen Δ5-Des (Pdes). La fosforilación del dominio regulador de DesR dimérico promueve, de manera cooperativa, la ocupación jerárquica de dos sitios de unión al ADN de DesR-P adyacentes, no idénticos, de modo que hay un cambio en el equilibrio hacia la forma activa tetramérica del regulador de respuesta. Posteriormente, esta propagación de la señal de fosforilación conduce a la activación del gen des a través del reclutamiento de ARN polimerasa a Pdes. Este es el primer ejemplo diseccionado de un factor de transcripción que funciona como un interruptor activado por fosforilación para un gen de choque frío, lo que permite a la célula optimizar la fluidez de los fosfolípidos de membrana. Todos los organismos deben comunicarse con su entorno para sobrevivir. Las células bacterianas monitorean las condiciones externas y procesan esta información para dar la respuesta más adecuada. Los sistemas regulatorios de dos componentes se han convertido en un paradigma para las respuestas adaptativas. En su forma más simple, un sistema de dos componentes contiene un sensor (histidina quinasa) y un regulador de respuesta (a menudo un activador transcripcional) (1Hoch J.A. Curr. Opin. Microbiol. 2000; 3: 165-170Crossref PubMed Scopus (632) Google Scholar). Los cambios en el entorno dan como resultado la fosforilación del sensor seguida de la transfosforilación en el regulador de respuesta (1Hoch J.A. Curr. Opin. Microbiol. 2000; 3: 165-170Crossref PubMed Scopus (632) Google Scholar, 2Fabret C. Feher V.A. Hoch J.A. J. Bacteriol. 1999; 181: 1975-1983 Crossref PubMed Google Scholar). Aunque los pares de reguladores de respuesta a quinasa de este tipo se informaron con frecuencia como gobernadores de una amplia variedad de vías en respuesta a una gran cantidad de señales (3Bourret R. Borkovich K. Simon M. Annu. Rev. Biochem. 1991; 60: 401-441Crossref PubMed Scopus (390) Google Scholar, 4Stock J. Surette M. Levit M. Park P. Hoch J. Silhavy T. Two Component Signal Transduction. American Society for Microbiology, Washington, D. C.1995: 25-51Google Scholar, 5Stock A. Robinson V. Goudreau P. Annu. Rev. Biochem. 2000; 69: 183-215Crossref PubMed Scopus (2431) Google Scholar), el requisito de este sistema para controlar la expresión génica durante el choque frío solo se ha descubierto recientemente en Bacillus subtilis (6Aguilar P.S. Hernandez-Arriaga A.M. Cybulski L.E. Erazo A.C. de Mendoza D. EMBO J. 2001; 20: 1681-1691Crossref PubMed Scopus (304) Google Scholar) y cianobacterias (7Suzuki I. Los D.A. Kanesaki Y. Mikami K. Murata N. EMBO J. 2000; 19: 1327-1334Crossref PubMed Scopus (219) Google Scholar). El choque frío es una condición de estrés que afecta negativamente el crecimiento de organismos poiquilotérmicos, como bacterias y plantas. Por lo tanto, comprender los mecanismos por los cuales estos organismos perciben señales de baja temperatura y transmiten esta información a la maquinaria celular para activar respuestas adaptativas es de fundamental importancia para la biología. Las bacterias y la mayoría (si no todos) los organismos poiquilotérmicos tienen que remodelar la composición lipídica de la membrana para sobrevivir a bajas temperaturas. B. subtilis (6Aguilar P.S. Hernandez-Arriaga A.M. Cybulski L.E. Erazo A.C. de Mendoza D. EMBO J. 2001; 20: 1681-1691Crossref PubMed Scopus (304) Google Scholar) y Synechocystis (7Suzuki I. Los D.A. Kanesaki Y. Mikami K. Murata N. EMBO J. 2000; 19: 1327-1334Crossref PubMed Scopus (219) Google Scholar) responden a una disminución de la temperatura ambiente de crecimiento mediante la introducción de dobles enlaces en las cadenas de acilo de sus fosfolípidos de membrana mediante desaturasas de lípidos de acilo unidas a la membrana. Esta modificación post-sintética de las cadenas de acilo saturadas parece estar diseñada para mejorar el efecto de los cambios de temperatura en el estado físico de los fosfolípidos de membrana. En Synechocystis se encontró que la inactivación de dos histidina quinasas modera la inducción a baja temperatura de los genes que codifican la desaturasa Δ6 y ω-3 (7Suzuki I. Los D.A. Kanesaki Y. Mikami K. Murata N. EMBO J. 2000; 19: 1327-1334Crossref PubMed Scopus (219) Google Scholar). Sin embargo, aún no se han identificado los reguladores transcripcionales de estos genes. Un ejemplo mejor entendido de percepción y transducción de señales de baja temperatura es la vía Des de B. subtilis, que regula la expresión de la acil lípido desaturasa, Δ5-Des. Esta vía responde a una disminución de la temperatura de crecimiento al mejorar la expresión del gen des que codifica Δ5-Des (8Aguilar P.S. Cronan Jr., J.E. de Mendoza D.J. Bacteriol. 1998; 180: 2194-2200Crossref PubMed Google Scholar, 9Aguilar P.S. López P. de Mendoza D. J. Bacteriol. 1999; 181: 7028-7033Crossref PubMed Google Scholar, 10Díaz A. Mansilla M.C. Vila A. de Mendoza D. J. Biol. Chem. 2002; 277: 48099-48106Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (58) Google Scholar, 11Altabe S. Aguilar P. Caballero G. de Mendoza D. J. Bacteriol. 2003; 185: 3228-3231 Crossref PubMed Scopus (66) Google Scholar). La vía del des está controlada de manera única y estricta por el sistema de dos componentes, DesK/DesR (6Aguilar P.S. Hernandez-Arriaga A.M. Cybulski L.E. Erazo A.C. de Mendoza D. EMBO J. 2001; 20: 1681-1691Crossref PubMed Scopus (304) Google Scholar). DesK es una histidina quinasa ubicada en la membrana y DesR es un regulador de la respuesta citoplasmática de 22,18 kDa que se une específicamente a la región promotora que controla. Los reguladores de respuesta se han clasificado de acuerdo con las similitudes en el dominio de unión al ADN. DesR pertenece al grupo NarL, en el que el dominio de unión C-terminal contiene un motivo hélice-giro-hélice (2Fabret C. Feher V.A. Hoch J.A. J. Bacteriol. 1999; 181: 1975-1983 Crossref PubMed Google Scholar). Basándonos en el paradigma del sistema de dos componentes y en trabajos anteriores, hemos propuesto que las dos proteínas se comunican a través de una serie de reacciones de fosforilación y fosfotransferencia. DesK detecta una disminución en la fluidez lipídica de la membrana y es autofosforilada por ATP intracelular en His-188 (12Cybulski L. Albanesi D. Mansilla M.C. Altabe S. de Mendoza D. Mol. Microbiol. 2002; 45: 1379-1388Crossref PubMed Scopus (98) Google Scholar, 13Albanesi D. Mansilla M.C. de Mendoza D. J. Bacteriol. 2004; 186: 2655-2663 Crossref PubMed Scopus (84) Google Scholar). Recientemente hemos demostrado que DesK-P es capaz de fosforilar DesR (13Albanesi D. Mansilla M.C. de Mendoza D. J. Bacteriol. 2004; 186: 2655-2663Crossref PubMed Scopus (84) Google Scholar) por lo que sugerimos que esta modificación covalente de DesR permite su interacción con la región reguladora de des, lo que lleva a la activación de la transcripción de des. Esta suposición se basó en el hecho de que aún no se ha encontrado que ningún regulador de la respuesta bacteriana sea activo en la forma no fosforilada, aunque algunos reguladores de la respuesta, como la levadura SSK1 I, son inactivos en la forma fosforilada (14Posas F. Saito H. EMBO J. 1998; 17: 1385-1394Crossref PubMed Scopus (249) Google Scholar). Aunque los estudios genéticos han demostrado que DesR es absolutamente necesario para la expresión de des, se desconoce si DesR es capaz de estimular la transcripción per se o si se requiere para estimular la síntesis o la actividad de otro factor necesario para la transcripción de des. En el presente estudio hemos examinado cómo la fosforilación influye en la capacidad de DesR para unirse al promotor des (Pdes). 1Las abreviaturas utilizadas son: Pdes, promotor des; RNAP, ARN polimerasa; EMSA, ensayo de cambio de movilidad electroforética; Ac-P, fosfato de acetilo; CI y CII, complejos I y II; RA y RB, regiones A y B; DR, repetición directa. 1Las abreviaturas utilizadas son: Pdes, promotor des; RNAP, ARN polimerasa; EMSA, ensayo de cambio de movilidad electroforética; Ac-P, fosfato de acetilo; CI y CII, complejos I y II; RA y RB, regiones A y B; DR, repetición directa. Nuestros resultados muestran que solo la forma fosforilada de DesR, DesR-P, es capaz de unirse a la región reguladora que controla. Además, demostramos que DesR es un dímero en solución que tiende a tetramerizarse tras la fosforilación, lo que podría explicar la interacción cooperativa entre moléculas de DesR-P unidas en sitios de unión reguladores de DesR adyacentes en Pdes. Mostramos que DesR-P activa la transcripción de des a través del reclutamiento de la ARN polimerasa (RNAP) al promotor des. De nuestros resultados ha surgido un modelo para el reconocimiento del promotor de DesR-P que discutimos en el contexto de la regulación transcripcional de la homeostasis de la fluidez de la membrana. Cepas bacterianas, plásmido y construcciones de cepas: las cepas bacterianas utilizadas en este trabajo se enumeran en la Tabla I de Materiales Suplementarios. La β-galactosidasa se analizó como se describió anteriormente (15Mansilla C. de Mendoza D. J. Bacteriol. 1997; 179: 76-981 Crossref Google Scholar). Para mutar la repetición invertida IR-L de las regiones que se protegieron en los experimentos de huella (Fig. 4), se utilizaron los oligonucleótidos I, II, III y IV para la amplificación de dos PCR de superposición-extensión (véase la Tabla II de Materiales Suplementarios). Se utilizó una mezcla de estos productos de PCR como molde de ADN para otra PCR utilizando los oligonucleótidos I y VII (16Horton R. Hunt H. Ho S. Pullen J. Pease L. Gene (Amst.). 1989; 77: 61-68 Crossref PubMed Scopus (2634) Google Scholar). El producto de amplificación de 301 pb se clonó en el vector integracional pJM116 (17Dartois V. Dérbarbouillé F. Kunst F. Rapaport G. J. Bacteriol. 1998; 180: 1855-1861 Crossref PubMed Google Scholar) para generar pLC118. Para mutar IR-R, se utilizaron los oligonucleótidos V y VI en lugar de II y III, y el plásmido resultante fue pLC119. Estos plásmidos se introdujeron en el locus amyE de la cepa JH642 dando las cepas LC118 y LC119, respectivamente. Se utilizó la misma estrategia para mutar el sitio de fosforilación putativo Asp-54 con Ala, utilizando los oligonucleótidos VIII, IX, X y XI. El producto de amplificación se clonó en el plásmido pGS791 2G. Schujman, comunicación personal. bajo el promotor de xilosa, produciendo el plásmido pLC90. Este plásmido se integró ectópicamente en el locus thrC de una cepa de B. subtilis que carece de DesR y contiene una fusión del gen indicador lacZ al promotor des (AKP9, ver Ref. 6Aguilar P.S. Hernandez-Arriaga A.M. Cybulski L.E. Erazo A.C. de Mendoza D. EMBO J. 2001; 20: 1681-1691 Crossref PubMed Scopus (304) Google Scholar) produciendo la cepa LC90. El desR de tipo salvaje se amplificó usando los oligonucleótidos VIII y XI, y se clonó de la misma manera que desRD54A, dando la cepa LC89. Todos los plásmidos se secuenciaron para confirmar la introducción de mutaciones. Ensayos de desplazamiento de movilidad en gel: se prepararon fragmentos de ADN que incluían el tipo salvaje o diferentes variantes del promotor des mediante PCR utilizando los cebadores XIII(PECO895) y VII(BAMO) (Materiales suplementarios, Tabla II). El ensayo se realizó como se describió anteriormente (6Aguilar P.S. HERNANDEZ-ARRIAGA A.M. Cybulski L.E. Erazo A.C. de Mendoza D. EMBO J. 2001; 20: 1681-1691Crossref PubMed Scopus (304) Google Scholar). Cuando se utilizó DesR fosforilado en la reacción, se incubó DesR de 6 μm durante 20 min a 0 °C en una mezcla que contenía Tris-HCl 50 mm, pH 8, MgCl2 5 mm, EDTA 0,5 mm, ditiotreitol 1,25 mm, glicerol al 10% y fosfato de acetilo 50 mm. Para la formación del complejo ternario, el fragmento de ADN se preparó utilizando los cebadores XIV y XV (Materiales Suplementarios Tabla II). Se añadió la holoenzima RNAP (Epicenter) a 100 nm y se incubó 30 min a 25 °C antes de ejecutar el gel. Cuando se incluyó heparina en la reacción, se añadió durante 5 min, a 60 μg/ml, después de la incubación con la RNAP. OH• Ensayos de Huella -El tratamiento con radicales hidroxilo se realizó esencialmente como se describe (18del Solar G.H. Pérez-Martin J. Espinosa M. J. Biol. Chem. 1990; 265: 12569-12575Abstract Full Text PDF PubMed Google Scholar). Una mezcla de reacción típica contenía un fragmento de ADN marcado en el extremo 5'de 2.6 nm que se extendía de –167 a +10 con respecto al sitio de inicio de la transcripción de des, DesR-P (300 o 1000 nm), Tris-HCl 25 mm, pH 8, ditiotreitol 1 mm, EDTA 0.25 mm, MgCl2 4 mm y 200 ng de poli(dI-dC). Después de 30 min de incubación a temperatura ambiente, se añadieron ascorbato de sodio 1 mm, H2O2 a 0.03% y Fe(EDTA)2– (concentraciones finales de 18 y 36 μm para Fe(II) y Na2EDTA, respectivamente), y la incubación se continuó durante 1 min a la misma temperatura. Las reacciones se detuvieron mediante la adición de una solución de tiourea/EDTA (concentraciones finales de 9,5 mm de tiourea y 1,7 mm de EDTA). Las mezclas se procesaron en un gel de poliacrilamida al 5% no desnaturalizante. El gel se expuso a una película autorradiográfica durante 5 min, y los complejos I y II se cortaron del gel. El ADN se eluyó, se precipitó, se cargó en geles de secuenciación de poliacrilamida al 8% desnaturalizantes y se procesó junto con los productos de las reacciones de secuenciación de Maxam y Gilbert (G + A) obtenidos a partir del mismo ADN marcado. El patrón de bandas se visualizó con un Fuji Film Phosphorimager. La separación de DesR de DesR-P-DesR o DesR fosforilado in vitro con fosfato de acetilo (Ac-P) durante 20 min se inyectó en una columna Vydac de fase inversa C4, utilizando un cromatógrafo líquido ÄKTA. El eluyente A fue ácido trifluoroacético al 0,1%, acetonitrilo al 20% en agua; el eluyente B fue ácido trifluoroacético al 0,1%, acetonitrilo al 60% en agua. La muestra se eluyó con un gradiente que varió de 80 a 0% A, durante 40 min. El eluyente B comenzó en el 20% y llegó al 100% en el mismo intervalo. El caudal fue de 1 ml/min. Ultracentrifugación analítica: los estudios de ultracentrifugación analítica se realizaron en un Beckman XL-A (Beckman Instruments Inc.) equipado con un sistema óptico UV-visible dentro de la microcentrífuga. Los experimentos de equilibrio de sedimentación se llevaron a cabo a 12.000 rpm y 20 °C en centros de mesa de ocho canales Epon con concentraciones de carga de proteína en el intervalo de 1–12 μm. El DesR se equilibró en un amortiguador que contenía Tris-HCl 50 mm, pH 8, MgCl2 5 mm, EDTA 0,5 mm, ditiotreitol 0,1 mm (y Ac-P 50 mm cuando se indicó). Se tomaron exploraciones de absorción radial a 231, 275 y 280 nm después de alcanzar el equilibrio de sedimentación. Las compensaciones de referencia se determinaron mediante centrifugación a alta velocidad (42.000 rpm). Los datos experimentales se analizaron utilizando el programa Sednterp versión 1.03 XLAEQ y EQASSOC (Beckman; 19Laue T.M. Shah B.D. Ridgeway T.M. Pelletier S.L. Harding S.E. Rowe A.J. Horton J.C. Analytical Ultracentrifugation in Biochemistry and Polymer Science. Royal Society of Chemistry, Cambridge1992: 90-125Google Scholar, 20Minton AP Schuster TM Laue TM Ultracentrifugación analítica moderna. Birkhauser, Boston, MA1994: 81-93 Crossref Google Scholar), utilizando un volumen específico parcial para DesR de 0,7449 ml g–1. Este valor se determinó en función de su composición de residuos de aminoácidos. Los valores de los coeficientes de extinción a 280 nm se calcularon a partir de los contenidos conocidos de residuos de triptófano y tirosina. Determinación del peso molecular de DesR mediante dispersión de luz estática: el peso molecular promedio (Mr) de DesR de tipo salvaje y su DesRD54A mutante tratado y no tratado con Ac-P se determinaron en un instrumento de dispersión de luz Precision Detector PD2010 conectado en tándem a un sistema de cromatografía líquida de alto rendimiento y un refractómetro diferencial LKB 2142. Las muestras se cargaron en una columna Sephadex G-25 (1 ml) y se eluyeron con Tris-HCl 50 mm, pH 8, NaCl 0,3 m, ditiotreitol 0,5 mm, a una velocidad de flujo de 0,3 ml/min. Las señales de dispersión de luz e índice de refracción de 90° del material eluyente se registraron en un ordenador PC y se analizaron con el software Discovery32 suministrado por Precision Detectors. El detector de dispersión de luz a 90° se calibró utilizando albúmina de suero bovino (66.5 kDa) como estándar. Ensayos de transcripción in vitro: se realizaron reacciones de transcripción in vitro (50 μl) en un tampón que contenía Tris-HCl 40 mm, pH 8, MgCl2 10 nm, KCl 150 mm, EDTA 0,1 mm y glicerol al 5%. Se preparó un fragmento de ADN que se extiende desde la posición –177 hasta la posición +43 mediante PCR utilizando oligonucleótidos PA y PC (Tabla Suplementaria II). El ADN (5 nm) se incubó primero con DesR-P (300 nm) durante 20 min a 25 °C y luego 10 min con RNAP (0,2 unidades) a la misma temperatura. Después, la mezcla se trató con 10 μg/ml de heparina durante 3 min a 37 °C. Las reacciones se iniciaron mediante la adición de 5 μl de una solución de 2 m de los cuatro NTP que contienen 0,5 μm [α-32P]UTP (400 Ci/mmol; 10 μCi/μl). Después de 5 min de incubación a 37 °C, la reacción se terminó mediante la adición de acetato de sodio, pH 7, a 300 mm, EDTA a 15 mm y ARNt a 100 μg/μl, y los ácidos nucleicos se precipitaron mediante la adición de 250 μl de etanol al 100%. Los productos se fraccionaron mediante electroforesis en geles de poliacrilamida al 8% que contenían 8 m de urea. La ecuación para calcular la constante de disociación relativa de los complejos regulador-ADN I y II-KdI y KdII representa las constantes de disociación para los complejos específicos I y II, respectivamente. fmaxCI representa el nivel máximo fraccional del complejo I alcanzado en las reacciones (21Tsai S. Tsai M. O'Malley B. Cell. 1989; 57: 443-448Abstract Full Text PDF PubMed Scopus (194) Google Scholar). ADN+DesR⇄KdICI⇄KdII↘DesRCII(Ec. 1) KdIKdII=[1fmaxCI−1]2(Ec. 2) La fosforilación de DesR aumenta la afinidad de unión a su ADN objetivo: deseábamos examinar cómo la fosforilación influye en la capacidad de DesR para unirse a una región de ADN que abarca Pdes mediante ensayos de desplazamiento de movilidad electroforética (EMSA) utilizando DesR o DesR-P, este último fosforilado in vitro con Ac-P. Con este fin, se incubó un fragmento de ADN de 216 pb marcado con [α-32P] dATP amplificado por PCR que se extiende desde las posiciones –187 a +29, en relación con el sitio de inicio de la transcripción de des, con proteínas DesR o DesR-P purificadas. Los resultados mostraron que Pdes exhibió cambios en su movilidad electroforética en presencia de DesR (Fig. 1A) o DesR-P (Fig. 1B); sin embargo, cuando se utilizó DesR-P, las concentraciones de proteína más bajas fueron suficientes para obtener la misma fracción de ADN complejado. El DesR fosforilado mostró unión al promotor des a concentraciones tan bajas como 0.06 μm. A esta concentración, se observó principalmente un complejo I (CI) de migración rápida. El aumento de la concentración de DesR-P mejoró progresivamente la formación del complejo II de migración lenta (CII; Fig. 1B). A 0.6 μm, CII es claramente el complejo proteína-ADN predominante. La formación de dos complejos diferentes, CI y CII, nos sugirió la existencia de dos sitios de unión para el regulador de respuesta. DesR sin tratamiento con Ac-P también pudo unirse a Pdes, pero se necesitaron concentraciones más altas para formar CI y CII (Fig. 1A). El sitio de fosforilación de DesR es Asp-54: el análisis comparativo de secuencias de reguladores de la respuesta bacteriana utilizando la alineación de secuencias múltiples con agrupamiento jerárquico (Multalin) indicó que Asp-54 de DesR debería ser el residuo que recibe el grupo fosforilo de la quinasa afín, DesK. Para determinar si este sitio de fosforilación putativo, Asp-54, estaba involucrado en la actividad de DesR, se sustituyó con ala usando mutagénesis dirigida al sitio. Los fragmentos de ADN que llevan desR + (tipo salvaje) o desR que codifican la proteína mutante (desRD54A) se proporcionaron en trans en un mutante desR nulo que lleva una fusión del gen indicador lacZ al promotor des. La expresión de desR + de tipo salvaje permitió la estimulación de la transcripción de des tras un cambio descendente de temperatura, mientras que la expresión de desRD54A no pudo estimular la transcripción de la fusión des-lacZ en las mismas condiciones (Materiales Suplementarios Fig. S1), lo que indica que el residuo Asp-54 es crucial para la actividad transcripcional de DesR in vivo. Confirmando esta conclusión, hemos determinado que la DesK autofosforilada sirve como fosfodonante de la proteína efectora DesR, pero no puede transferir el grupo fosforilo a DesRD54A (datos no mostrados). La forma no fosforilada de DesR no puede unirse al promotor de des: algunos reguladores de respuesta como B. subtilis PhoP se unen a sus promotores objetivo en forma no fosforilada o fosforilada. Sin embargo, la forma no fosforilada de PhoP no puede activar la transcripción (22Liu W. Hulett M. J. Bacteriol. 1997; 179: 6302-6310 Crossref PubMed Google Scholar). Como se muestra en la Fig. 1A, DesR se une a Pdes incluso sin tratamiento previo con Ac-P, aunque los experimentos in vivo (descritos en Materiales Suplementarios Fig. S1) indicó que la fosforilación de Asp-54 es crucial para la actividad de DesR. Esto sugirió que DesR se comportaba de manera similar a PhoP. Si este fuera el caso, DesRD54A debería unirse a Pdes en EMSA, de la misma manera que DesR no fosforilado, pero el tratamiento de DesRD54A con Ac-P no debería aumentar su afinidad de unión. Para evaluar esta posibilidad, se probó la unión de DesRD54A purificado a Pdes utilizando EMSA. Sorprendentemente, DesRD54A no pudo unirse a Pdes a ninguna concentración probada incluso cuando se trató con Ac-P (Materiales Suplementarios Fig. S2A). Este resultado podría atribuirse a: (i) la forma no fosforilada de DesR no se une a Pdes, y la actividad de unión observada en el experimento que se muestra en la Fig. 1A se debió a la fosforilación inespecífica de DesR durante su sobreproducción en Escherichia coli, o (ii) la mutación puntual Asp-Ala en DesRD54A provocó un cambio conformacional que abolió la unión del regulador de respuesta mutado a Pdes. Para distinguir entre estas dos posibilidades, el DesR purificado de E. coli se sometió a cromatografía líquida de alto rendimiento de fase inversa (Materiales Suplementarios Fig. S2B). DesR mostró dos picos que corresponden a la forma fosforilada y no fosforilada del regulador. Cuando se incubó DesR extraído de E. coli con Ac-P, el pico correspondiente a DesR-P aumentó considerablemente (Materiales Suplementarios Fig. S2C). Este resultado indica que aproximadamente el 50% de DesR marcado con His purificado de E. coli está fosforilado, y que esta forma podría ser responsable de la actividad de unión de DesR sin tratamiento con Ac-P en los ensayos EMSA mostrados en la Fig. 1A. Vale la pena mencionar que el análisis de dicroísmo circular mostró que DesRD54A presenta la misma estructura secundaria global que DesR de tipo salvaje (Materiales Suplementarios Fig. S2D), apoyando la conclusión de que este regulador mutante no se une a Pdes porque no puede fosforilarse en el aspartato conservado por Ac-P, en lugar de por un cambio estructural producido por la mutación. Para demostrar directamente que la forma no fosforilada de DesR no se une a su promotor objetivo, aprovechamos la ventaja de observar que DesR-P se desfosforila completamente después de la incubación a 25 °C durante 12 h (13Albanesi D. Mansilla M.C. de Mendoza D. J. Bacteriol. 2004; 186: 2655-2663 Crossref PubMed Scopus (84) Google Scholar). Probamos por EMSA el retraso de Pdes en presencia de DesR no tratado (ya que eluye de la columna de níquel-ácido nitrilotriacético), DesR desfosforilado por incubación a 25 °C durante 12 h, o DesR desfosforilado a 25 °C y fosforilado nuevamente por tratamiento con Ac-P. Fig. 2A muestra que el DesR no tratado forma dos complejos (carriles 2–4), mientras que el DesR desfosforilado a 25 °C no puede unirse al Pdes (carriles 5–7). Como se esperaba, cuando este DesR no fosforilado se incubó con Ac-P, recuperó la actividad de unión al ADN (carriles 8–10). A partir de ahora, llamaremos "DesR no fosforilada" a la proteína que se incubó 12 h a 25 °C. Además, la incubación de DesR no fosforilado con concentraciones crecientes de Ac-P dio como resultado una mejora similar de la unión del regulador de respuesta, alcanzando un máximo a 50 mm del donante de fosforilo (Fig. 2B). A partir de los resultados anteriores podemos sacar dos conclusiones: (i) el grado de fosforilación de DesR determina su capacidad de unión, y (ii) DesR no fosforilado es incapaz de unirse a su promotor diana. Cabe mencionar que cuando DesRD54A se incubó con Ac-P de 50 mm y luego se sometió a cromatografía líquida de alto rendimiento, detectamos que un sitio o sitios secundarios de la proteína estaban fosforilados (datos no mostrados). Sin embargo, como se muestra en Materiales Suplementarios Fig. S2A, la fosforilación de este sitio secundario no pudo estimular la unión de DesRD54A a Pdes. DesR es un dímero en solución y se tetrameriza tras la fosforilación: la fosforilación promueve la formación de dímeros o incluso oligómeros de muchos reguladores de respuesta; sin embargo, otros reguladores de respuesta no cambian su estado de asociación tras la fosforilación (23Jeon Y. Lee Y. Han J. Kim J. Hwang D. J. Biol. Chem. 2001; 276: 40873-40879Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (74) Google Scholar, 24Lewis R. Scott D. Brannigan J. Ladds J. Cervin M. Spiegelman G. Hogget J. Barák I. Wilkinson A. J. Mol. Biol. 2002; 316: 235-245Crossref PubMed Scopus (1) Google Scholar, 25Wyman C. Rombel I. North A. Bustamente C. Kustu S. Science. 2000; 275: 1658-1661Crossref Scopus (209) Google Scholar, 26Da Re S. Schumacher J. Rousseau P. Fourment J. Ebel C. Kahn D. Mol. Microbiol. 1999; 34: 504-511Crossref PubMed Scopus (89) Google Scholar). La existencia de dos complejosDesR-P ·ADN (Figs. 1 y 2) indica que la fosforilación de DesR favorece la unión de más de una subunidad de la proteína al promotor des. Para estudiar el estado de asociación de DesR o DesR-P, realizamos experimentos de equilibrio de sedimentación mediante ultracentrifugación analítica. En el caso de DesR-P fue necesario definir las condiciones experimentales requeridas para estabilizar la forma fosforilada durante el transcurso del ensayo de sedimentación. Debido a que la vida media de DesR-P a 25 °C es de aproximadamente 90 min (13Albanesi D. Mansilla M.C. de Mendoza D. J. Bacteriol. 2004; 186: 2655-2663Crossref PubMed Scopus (84) Google Scholar), se mantuvo un alto estado estacionario de fosforilación in situ mediante la inclusión de un exceso de Ac-P en la muestra sometida a ultracentrifugación analítica. Las ejecuciones de ultracentrifugación se realizaron con DesR no fosforilado o con DesR-P a concentraciones en el intervalo de 1 a 12 μm. El DesR no fosforilado se comportó como un dímero en solución a cada concentración probada, porque todos los datos experimentales se ajustan a la curva predicha de Sednterp para un dímero (Materiales Suplementarios Fig. S3A) .Cuando DesR se sometió a ultracentrifugación analítica en presencia de Ac-P, su comportamiento hidrodinámico cambió considerablemente, especialmente a la concentración de proteína más alta, en la que el tetrámero se convirtió en la especie más abundante (Materiales Suplementarios Fig. S3B), aunque el mejor ajuste incluye constantes para multímeros de orden superior. Esto sugiere que la fosforilación de DesR promueve una nueva interacción entre los dímeros de DesR. Las gráficas de la masa molecular flotante frente a la concentración de proteína (1–12 μm) indicaron que a bajas concentraciones de proteína, la masa molecular de DesR-P correspondía a un dímero (Materiales Suplementarios Fig. S3C). A medida que aumentaban los niveles de DesR-P, la masa de la especie se hacía más grande, alcanzando la masa de un tetrámero. Este es un comportamiento característico de un sistema en equilibrio; de lo contrario, la dilución no afectaría la masa molecular media de la especie. Para confirmar las propiedades hidrodinámicas de DesR obtenidas por ultracentrifugación analítica y para investigar el fenómeno de tetramerización en ausencia de fosforilación continua por Ac-P, recurrimos a experimentos de dispersión de luz estática. Con este fin, las soluciones de DesR no fosforilado o DesR incubado con Ac-P se dializaron durante 20 min para eliminar el agente fosforilante. A continuación, se examinó la intensidad dispersa total a 90°. El peso molecular promedio de DesR fue de 41,553, y el de DesR-P fue de 71,834, correspondientes a 1.94 y 3.36 unidades de DesR, respectivamente. Este último número fraccionario sugirió que en esta condición la fosforilación con Ac-P no se completa, y que aproximadamente el 70% de DesR se fosforiló en esta muestra. Los experimentos de control con DesRD54A mostraron un peso molecular medio correspondiente a un dímero independientemente del tratamiento con Ac-P. En conjunto, estos experimentos demostraron que DesR es un dímero en solución que forma principalmente tetrámeros tras la fosforilación. Los contactos de alta resolución de DesR en sus ensayos de huellas de ADNasa I anteriores a la diana han demostrado que DesR se une a una secuencia de ADN que se extiende desde las posiciones –28 a –77 en relación con el sitio de inicio de la transcripción de des, generando 5 regiones protegidas en cada cadena (6Aguilar P.S. Hernandez-Arriaga A.M. Cybulski L.E. Erazo A.C. de Mendoza D. EMBO J. 2001; 20: 1681-1691Crossref PubMed Scopus (304) Google Scholar). Se encontraron dos repeticiones invertidas (5′ -TCAT-3 ′) separadas por 9 nucleótidos en el centro de la región protegida. Para obtener un perfil de alta resolución de los contactos entre DesR-P y su ADN diana recurrimos a

The Des pathway of Bacillus subtilis regulates the synthesis of the cold-shock induced membrane-bound enzyme Δ5-fatty acid desaturase (Δ5-Des). A central component of the Des pathway is the response regulator, DesR, which is activated by a membrane-associated kinase, DesK, in response to a decrease in membrane lipid fluidity. Despite genetic and biochemical studies, specific details of the interaction between DesR and the DNA remain unknown. In this study we show that only the phosphorylated form of protein DesR is able to bind to a regulatory region immediately upstream of the promoter of the Δ5-Des gene (Pdes). Phosphorylation of the regulatory domain of dimeric DesR promotes, in a cooperative fashion, the hierarchical occupation of two adjacent, non-identical, DesR-P DNA binding sites, so that there is a shift in the equilibrium toward the tetrameric active form of the response regulator. Subsequently, this phosphorylation signal propagation leads to the activation of the des gene through recruitment of RNA polymerase to Pdes. This is the first dissected example of a transcription factor functioning as a phosphorylation-activated switch for a cold-shock gene, allowing the cell to optimize the fluidity of membrane phospholipids. The Des pathway of Bacillus subtilis regulates the synthesis of the cold-shock induced membrane-bound enzyme Δ5-fatty acid desaturase (Δ5-Des). A central component of the Des pathway is the response regulator, DesR, which is activated by a membrane-associated kinase, DesK, in response to a decrease in membrane lipid fluidity. Despite genetic and biochemical studies, specific details of the interaction between DesR and the DNA remain unknown. In this study we show that only the phosphorylated form of protein DesR is able to bind to a regulatory region immediately upstream of the promoter of the Δ5-Des gene (Pdes). Phosphorylation of the regulatory domain of dimeric DesR promotes, in a cooperative fashion, the hierarchical occupation of two adjacent, non-identical, DesR-P DNA binding sites, so that there is a shift in the equilibrium toward the tetrameric active form of the response regulator. Subsequently, this phosphorylation signal propagation leads to the activation of the des gene through recruitment of RNA polymerase to Pdes. This is the first dissected example of a transcription factor functioning as a phosphorylation-activated switch for a cold-shock gene, allowing the cell to optimize the fluidity of membrane phospholipids. All organisms must communicate with their environment to survive. Bacterial cells monitor external conditions and process this information to give the most appropriate response. Two-component regulatory systems have emerged as a paradigm for adaptive responses. In its simplest form, a two-component system contains a sensor (histidine kinase) and a response regulator (often a transcriptional activator) (1Hoch J.A. Curr. Opin. Microbiol. 2000; 3: 165-170Crossref PubMed Scopus (632) Google Scholar). Changes in the environment result in phosphorylation of the sensor followed by transphosphorylation onto the response regulator (1Hoch J.A. Curr. Opin. Microbiol. 2000; 3: 165-170Crossref PubMed Scopus (632) Google Scholar, 2Fabret C. Feher V.A. Hoch J.A. J. Bacteriol. 1999; 181: 1975-1983Crossref PubMed Google Scholar). Although kinase-response regulator pairs of this type were frequently reported as governors of a wide variety of pathways in response to a myriad of signals (3Bourret R. Borkovich K. Simon M. Annu. Rev. Biochem. 1991; 60: 401-441Crossref PubMed Scopus (390) Google Scholar, 4Stock J. Surette M. Levit M. Park P. Hoch J. Silhavy T. Two Component Signal Transduction. American Society for Microbiology, Washington, D. C.1995: 25-51Google Scholar, 5Stock A. Robinson V. Goudreau P. Annu. Rev. Biochem. 2000; 69: 183-215Crossref PubMed Scopus (2431) Google Scholar), the requirement of this system to control gene expression during cold-shock has only recently been discovered in Bacillus subtilis (6Aguilar P.S. Hernandez-Arriaga A.M. Cybulski L.E. Erazo A.C. de Mendoza D. EMBO J. 2001; 20: 1681-1691Crossref PubMed Scopus (304) Google Scholar) and cyanobacteria (7Suzuki I. Los D.A. Kanesaki Y. Mikami K. Murata N. EMBO J. 2000; 19: 1327-1334Crossref PubMed Scopus (219) Google Scholar). Cold shock is a stress condition that adversely affects the growth of poikilothermic organisms, such as bacteria and plants. Thus, understanding the mechanisms by which these organisms perceive low temperature signals and transmit this information to the cellular machinery to activate adaptive responses is of fundamental importance to biology. Bacteria and most (if not all) poikilothermic organisms have to remodel the membrane lipid composition to survive at low temperatures. B. subtilis (6Aguilar P.S. Hernandez-Arriaga A.M. Cybulski L.E. Erazo A.C. de Mendoza D. EMBO J. 2001; 20: 1681-1691Crossref PubMed Scopus (304) Google Scholar) and Synechocystis (7Suzuki I. Los D.A. Kanesaki Y. Mikami K. Murata N. EMBO J. 2000; 19: 1327-1334Crossref PubMed Scopus (219) Google Scholar) respond to a decrease in the ambient growth temperature by introducing double bonds into the acyl chains of their membrane phospholipids by membrane-bound acyl lipid desaturases. This post-synthetic modification of the saturated acyl chains seems to be designed to ameliorate the effect of temperature changes on the physical state of membrane phospholipids. In Synechocystis it was found that inactivation of two histidine kinases moderates the low-temperature induction of the genes coding for Δ6 and ω-3 desaturase (7Suzuki I. Los D.A. Kanesaki Y. Mikami K. Murata N. EMBO J. 2000; 19: 1327-1334Crossref PubMed Scopus (219) Google Scholar). However, the transcriptional regulators of these genes were not yet identified. A better understood example of perception and transduction of low temperature signals is the Des pathway of B. subtilis, which regulates the expression of the acyl lipid desaturase, Δ5-Des. This pathway responds to a decrease in growth temperature by enhancing the expression of the des gene coding for Δ5-Des (8Aguilar P.S. Cronan Jr., J.E. de Mendoza D. J. Bacteriol. 1998; 180: 2194-2200Crossref PubMed Google Scholar, 9Aguilar P.S. Lopez P. de Mendoza D. J. Bacteriol. 1999; 181: 7028-7033Crossref PubMed Google Scholar, 10Díaz A. Mansilla M.C. Vila A. de Mendoza D. J. Biol. Chem. 2002; 277: 48099-48106Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (58) Google Scholar, 11Altabe S. Aguilar P. Caballero G. de Mendoza D. J. Bacteriol. 2003; 185: 3228-3231Crossref PubMed Scopus (66) Google Scholar). The Des pathway is uniquely and stringently controlled by the two-component system, DesK/DesR (6Aguilar P.S. Hernandez-Arriaga A.M. Cybulski L.E. Erazo A.C. de Mendoza D. EMBO J. 2001; 20: 1681-1691Crossref PubMed Scopus (304) Google Scholar). DesK is a histidine kinase located in the membrane and DesR is a 22.18-kDa cytoplasmic response regulator that binds specifically to the promoter region it controls. Response regulators have been classified according to similarities in the DNA binding domain. DesR belongs to the NarL group, in which the C-terminal binding domain contains a helix-turn-helix motif (2Fabret C. Feher V.A. Hoch J.A. J. Bacteriol. 1999; 181: 1975-1983Crossref PubMed Google Scholar). Based on the two-component system paradigm and on previous work, we have proposed that the two proteins communicate via a series of phosphorylation and phosphotransfer reactions. DesK senses a decrease in membrane lipid fluidity and is autophosphorylated by intracellular ATP at His-188 (12Cybulski L. Albanesi D. Mansilla M.C. Altabe S. de Mendoza D. Mol. Microbiol. 2002; 45: 1379-1388Crossref PubMed Scopus (98) Google Scholar, 13Albanesi D. Mansilla M.C. de Mendoza D. J. Bacteriol. 2004; 186: 2655-2663Crossref PubMed Scopus (84) Google Scholar). We have recently demonstrated that DesK-P is able to phosphorylate DesR (13Albanesi D. Mansilla M.C. de Mendoza D. J. Bacteriol. 2004; 186: 2655-2663Crossref PubMed Scopus (84) Google Scholar) so we suggested that this covalent modification of DesR allows its interaction with the des regulatory region, leading to activation of des transcription. This assumption was based on the fact that no bacterial response regulator has yet been found to be active in the unphosphorylated form, although some response regulators, such as yeast SSK1 I, are inactive in the phosphorylated form (14Posas F. Saito H. EMBO J. 1998; 17: 1385-1394Crossref PubMed Scopus (249) Google Scholar). Although genetic studies have shown that DesR is absolutely necessary for des expression, it is unknown whether DesR is able to stimulate transcription per se or it is required to stimulate the synthesis or activity of another factor necessary for des transcription. In the present study we have examined how phosphorylation influences the ability of DesR to bind to the des promoter (Pdes). 1The abbreviations used are: Pdes, des promoter; RNAP, RNA polymerase; EMSA, electrophoretic mobility shift assay; Ac-P, acetyl phosphate; CI and CII, complexes I and II; RA and RB, regions A and B; DR, direct repeat. 1The abbreviations used are: Pdes, des promoter; RNAP, RNA polymerase; EMSA, electrophoretic mobility shift assay; Ac-P, acetyl phosphate; CI and CII, complexes I and II; RA and RB, regions A and B; DR, direct repeat. Our results show that only the phosphorylated form of DesR, DesR-P, is able to bind to the regulatory region it controls. In addition, we demonstrate that DesR is a dimer in solution that tends to tetramerize upon phosphorylation, which could account for cooperative interaction between molecules of DesR-P bound at adjacent DesR regulatory binding sites at Pdes. We show that DesR-P activates des transcription through recruitment of the RNA polymerase (RNAP) to the des promoter. A model for DesR-P promoter recognition has emerged from our results that we discuss in the context of transcriptional regulation of membrane fluidity homeostasis. Bacterial Strains, Plasmid, and Strain Constructions—The bacterial strains used in this work are listed in Supplementary Materials Table I. β-Galactosidase was assayed as previously described (15Mansilla C. de Mendoza D. J. Bacteriol. 1997; 179: 76-981Crossref Google Scholar). To mutate the IR-L inverted repeat of the regions that were protected in footprinting experiments (Fig. 4), oligonucleotides I, II, III, and IV were used for the amplification of two overlap-extension PCR (see Supplementary Materials Table II). A mixture of these PCR products was used as DNA template for another PCR using oligonucleotides I and VII (16Horton R. Hunt H. Ho S. Pullen J. Pease L. Gene (Amst.). 1989; 77: 61-68Crossref PubMed Scopus (2634) Google Scholar). The 301-bp amplification product was cloned into the integrational vector pJM116 (17Dartois V. Dérbarbouillé F. Kunst F. Rapaport G. J. Bacteriol. 1998; 180: 1855-1861Crossref PubMed Google Scholar) to generate pLC118. To mutate IR-R, oligonucleotides V and VI were utilized instead of II and III, and the resulting plasmid was pLC119. These plasmids were introduced into the amyE locus of strain JH642 giving strains LC118 and LC119, respectively. The same strategy was used to mutate the putative phosphorylation site Asp-54 with Ala, using oligonucleotides VIII, IX, X, and XI. The amplification product was cloned into plasmid pGS791 2G. Schujman, personal communication. under the xylose promoter, yielding plasmid pLC90. This plasmid was integrated ectopically in the thrC locus of a B. subtilis strain that lacks DesR and contains a fusion of the lacZ reporter gene to the des promoter (AKP9, see Ref. 6Aguilar P.S. Hernandez-Arriaga A.M. Cybulski L.E. Erazo A.C. de Mendoza D. EMBO J. 2001; 20: 1681-1691Crossref PubMed Scopus (304) Google Scholar) yielding strain LC90. Wild type desR was amplified using oligonucleotides VIII and XI, and was cloned in the same way as desRD54A, giving strain LC89. All plasmids were sequenced to confirm the introduction of mutations. Gel Mobility Shift Assays—DNA fragments including the wild type or different des promoter variants were prepared by PCR using primers XIII(PECO895) and VII(BAMO) (Supplementary Materials Table II). The assay was performed as described previously (6Aguilar P.S. Hernandez-Arriaga A.M. Cybulski L.E. Erazo A.C. de Mendoza D. EMBO J. 2001; 20: 1681-1691Crossref PubMed Scopus (304) Google Scholar). When phosphorylated DesR was used in the reaction, 6 μm DesR was incubated for 20 min at 0 °C in a mixture containing 50 mm Tris-HCl, pH 8, 5 mm MgCl2, 0.5 mm EDTA, 1.25 mm dithiothreitol, 10% glycerol, and 50 mm acetyl phosphate. For the ternary complex formation, the DNA fragment was prepared using the primers XIV and XV (Supplementary Materials Table II). The RNAP Holoenzyme (Epicenter) was added at 100 nm and incubated 30 min at 25 °C before running the gel. When heparin was included in the reaction, it was added for 5 min, at 60 μg/ml, after the incubation with the RNAP. OH•Footprinting Assays—Hydroxyl radical treatment was performed essentially as described (18del Solar G.H. Pérez-Martin J. Espinosa M. J. Biol. Chem. 1990; 265: 12569-12575Abstract Full Text PDF PubMed Google Scholar). A typical reaction mixture contained 2.6 nm 5′-end-labeled DNA fragment extending from –167 to +10 relative to the des transcription start site, DesR-P (300 or 1000 nm), 25 mm Tris-HCl, pH 8, 1 mm dithiothreitol, 0.25 mm EDTA, 4 mm MgCl2, and 200 ng of poly(dI-dC). After 30 min incubation at room temperature, 1 mm sodium ascorbate, H2O2 to 0.03%, and Fe(EDTA)2– (final concentrations of 18 and 36 μm for Fe(II) and Na2EDTA, respectively) were added, and the incubation was continued for 1 min at the same temperature. The reactions were stopped by the addition of a thiourea/EDTA solution (final concentrations of 9.5 mm thiourea and 1.7 mm EDTA). Mixes were run in a non-denaturing 5% polyacrylamide gel. The gel was exposed to an autoradiographic film for 5 min, and complexes I and II were cut out of the gel. The DNA was eluted, precipitated, loaded on denaturing 8% polyacrylamide sequencing gels, and run together with the products of sequencing reactions of Maxam and Gilbert (G + A) obtained from the same labeled DNA. The band pattern was visualized using a Fuji Film Phosphorimager. Separation of DesR from DesR-P—DesR or DesR phosphorylated in vitro with acetyl phosphate (Ac-P) for 20 min were injected on a C4 reversed phase Vydac column, using an ÄKTA Liquid chromatograph. Eluent A was 0.1% trifluoroacetic acid, 20% acetonitrile in water; eluent B was 0.1% trifluoroacetic acid, 60% acetonitrile in water. The sample was eluted with a gradient that varied from 80 to 0% A, over 40 min. Eluent B started at 20% and went to 100% over the same interval. The flow rate was 1 ml/min. Analytical Ultracentrifugation—Analytical ultracentrifugation studies were performed in a Beckman XL-A (Beckman Instruments Inc.) equipped with a UV-visible optic system inside the microcentrifuge. Sedimentation equilibrium experiments were carried out at 12,000 rpm and 20 °C in Epon eight-channel centerpieces with protein loading concentrations in the range of 1–12 μm. DesR was equilibrated in a buffer containing 50 mm Tris-HCl, pH 8, 5 mm MgCl2, 0.5 mm EDTA, 0.1 mm dithiothreitol (and 50 mm Ac-P when indicated). Radial absorption scans at 231, 275, and 280 nm were taken after the sedimentation equilibrium was reached. Baseline offsets were determined by high-speed centrifugation (42,000 rpm). Experimental data were analyzed using the program Sednterp version 1.03 XLAEQ and EQASSOC (Beckman; 19Laue T.M. Shah B.D. Ridgeway T.M. Pelletier S.L. Harding S.E. Rowe A.J. Horton J.C. Analytical Ultracentrifugation in Biochemistry and Polymer Science. Royal Society of Chemistry, Cambridge1992: 90-125Google Scholar, 20Minton A.P. Schuster T.M. Laue T.M. Modern Analytical Ultracentrifugation. Birkhauser, Boston, MA1994: 81-93Crossref Google Scholar), using a partial specific volume for DesR of 0.7449 ml g–1. This value was determined on the basis of its amino acid residue composition. The values of extinction coefficients at 280 nm were calculated from the known tryptophan and tyrosine residue contents. Determination of the Molecular Weight of DesR by Static Light Scattering—The average molecular weight (Mr) of wild type DesR and its mutant DesRD54A treated and non-treated with Ac-P were determined on a Precision Detector PD2010 light scattering instrument tandemly connected to an high performance liquid chromatography system and a LKB 2142 differential refractometer. The samples were loaded on a Sephadex G-25 (1 ml) column and eluted with 50 mm Tris-HCl, pH 8, 0.3 m NaCl, 0.5 mm dithiothreitol, at a flow rate of 0.3 ml/min. The 90° light scattering and refractive index signals of the eluting material were recorded on a PC computer and analyzed with the Discovery32 software supplied by Precision Detectors. The 90° light scattering detector was calibrated using bovine serum albumin (66.5 kDa) as a standard. In Vitro Transcription Assays—In vitro transcription reactions (50 μl) were performed in a buffer containing 40 mm Tris-HCl, pH 8, 10 nm MgCl2, 150 mm KCl, 0.1 mm EDTA, and 5% glycerol. A DNA fragment extending from position –177 to position +43 was prepared by PCR using oligonucleotides PA and PC (Supplementary Table II). The DNA (5 nm) was incubated first with DesR-P (300 nm) for 20 min at 25 °C, and then 10 min with RNAP (0.2 units) at the same temperature. The mixture was then treated with 10 μg/ml heparin for 3 min at 37 °C. Reactions were started by the addition of 5 μl of a solution 2 m of the four NTPs containing 0.5 μm [α-32P]UTP (400 Ci/mmol; 10 μCi/μl). After 5 min of incubation at 37 °C, the reaction was terminated by the addition of sodium acetate, pH 7, to 300 mm, EDTA to 15 mm, and tRNA to 100 μg/μl, and the nucleic acids were precipitated by the addition of 250 μl of 100% ethanol. The products were fractionated by electrophoresis on 8% polyacrylamide gels containing 8 m urea. Equation to Calculate the Relative Dissociation Constant of Regulator-DNA Complexes I and II—KdI and KdII represent the dissociation constants for specific complexes I and II, respectively. fmaxCI represents the fractional maximum level of complex I attained in the reactions (21Tsai S. Tsai M. O'Malley B. Cell. 1989; 57: 443-448Abstract Full Text PDF PubMed Scopus (194) Google Scholar). DNA+DesR⇄KdICI⇄KdII↘DesRCII(Eq. 1) KdIKdII=[1fmaxCI−1]2(Eq. 2) Phosphorylation of DesR Increases the Affinity of Binding to Its Target DNA—We wished to examine how phosphorylation influences the ability of DesR to bind to a DNA region spanning Pdes by electrophoretic mobility shift assays (EMSA) using DesR or DesR-P, this latter phosphorylated in vitro with Ac-P. To this end, a PCR-amplified [α-32P]dATP-labeled 216-bp DNA fragment extending from positions –187 to +29, relative to the des transcription start site, was incubated with purified DesR or DesR-P proteins. The results showed that Pdes exhibited changes in its electrophoretic mobility in the presence of either DesR (Fig. 1A) or DesR-P (Fig. 1B); however, when DesR-P was used, lower protein concentrations were sufficient to obtain the same fraction of complexed DNA. Phosphorylated DesR showed binding to the des promoter at concentrations as low as 0.06 μm. At this concentration a fast migrating complex I (CI) was mainly observed. Increasing DesR-P concentration enhanced progressively the formation of the slow-migrating complex II (CII; Fig. 1B). At 0.6 μm, CII is clearly the predominant protein-DNA complex. Formation of two different complexes, CI and CII, suggested to us the existence of two binding sites for the response regulator. DesR without Ac-P treatment was also able to bind to Pdes, but higher concentrations were needed to form CI and CII (Fig. 1A). DesR Phosphorylation Site Is Asp-54—Sequence comparative analysis of bacterial response regulators using multiple sequence alignment with hierarchical clustering (Multalin) indicated that Asp-54 of DesR should be the residue that receives the phosphoryl group from the cognate kinase, DesK. To determine whether this putative phosphorylation site, Asp-54, was involved in DesR activity, it was substituted with Ala using site-directed mutagenesis. DNA fragments carrying either desR+ (wild type) or desR encoding the mutant protein (desRD54A) were provided in trans into a desR null mutant carrying a fusion of the lacZ reporter gene to the des promoter. The expression of wild type desR+ allowed stimulation of des transcription upon a temperature downshift, whereas the expression of desRD54A could not stimulate transcription of the des-lacZ fusion under the same conditions (Supplemental Materials Fig. S1), indicating that residue Asp-54 is crucial for in vivo DesR transcriptional activity. Confirming this conclusion, we have determined that autophosphorylated DesK serves as a phosphodonor of the effector protein DesR, but cannot transfer the phosphoryl group to DesRD54A (data not shown). The Unphosphorylated Form of DesR Is Unable to Bind to the des Promoter—Some response regulators such as B. subtilis PhoP bind to its target promoters either in the unphosphorylated or in the phosphorylated form. However, the unphosphorylated form of PhoP is unable to activate transcription (22Liu W. Hulett M. J. Bacteriol. 1997; 179: 6302-6310Crossref PubMed Google Scholar). As shown in Fig. 1A, DesR binds to Pdes even without previous treatment with Ac-P, although in vivo experiments (described in Supplemental Materials Fig. S1) indicated that phosphorylation of Asp-54 is crucial for DesR activity. This suggested that DesR behaved similarly to PhoP. If this were the case, DesRD54A should bind to Pdes in EMSA, in the same way as unphosphorylated DesR, but treatment of DesRD54A with Ac-P should not increase its binding affinity. To evaluate this possibility, binding of purified DesRD54A to Pdes was tested using EMSA. Surprisingly, DesRD54A was unable to bind to Pdes at any tested concentration even when treated with Ac-P (Supplemental Materials Fig. S2A). This result could be attributed to: (i) the unphosphorylated form of DesR does not bind to Pdes, and the binding activity observed in the experiment shown in Fig. 1A was because of nonspecific phosphorylation of DesR during its overproduction in Escherichia coli, or (ii) the point mutation Asp-Ala in DesRD54A provoked a conformational change that abolished the binding of the mutated response regulator to Pdes. To distinguish between these two possibilities, DesR purified from E. coli was subjected to reverse phase high performance liquid chromatography (Supplemental Materials Fig. S2B). DesR showed two peaks that correspond to the phosphorylated and unphosphorylated form of the regulator. When DesR extracted from E. coli was incubated with Ac-P, the peak corresponding to DesR-P increased considerably (Supplemental Materials Fig. S2C). This result indicates that about 50% of His-tagged DesR purified from E. coli is phosphorylated, and that this form could be responsible for the binding activity of DesR without Ac-P treatment in the EMSA assays showed in Fig. 1A. It is worth mentioning that circular dichroism analysis showed that DesRD54A presents the same global secondary structure as wild type DesR (Supplemental Materials Fig. S2D), supporting the conclusion that this mutant regulator does not bind to Pdes because it is unable to be phosphorylated in the conserved aspartate by Ac-P, rather than by a structural change produced by the mutation. To demonstrate directly that the unphosphorylated form of DesR does not bind to its target promoter, we took advantage of the observation that DesR-P is completely dephosphorylated after incubation at 25 °C for 12 h (13Albanesi D. Mansilla M.C. de Mendoza D. J. Bacteriol. 2004; 186: 2655-2663Crossref PubMed Scopus (84) Google Scholar). We tested by EMSA the retardation of Pdes in the presence of untreated DesR (as it elutes from the nickel-nitrilotriacetic acid column), DesR dephosphorylated by incubation at 25 °C for 12 h, or DesR dephosphorylated at 25 °C and phosphorylated again by treatment with Ac-P. Fig. 2A shows that untreated DesR forms two complexes (lanes 2–4), whereas DesR dephosphorylated at 25 °C is unable to bind to Pdes (lanes 5–7). As expected, when this unphosphorylated DesR was incubated with Ac-P, it recovered the DNA binding activity (lanes 8–10). From now on, we will call "unphosphorylated DesR" the protein that was incubated 12 h at 25 °C. In addition, incubation of unphosphorylated DesR with increasing concentrations of Ac-P resulted in a similar enhancement of the binding of the response regulator, reaching a maximum at 50 mm of the phosphoryl donor (Fig. 2B). From the above results we can draw two conclusions: (i) the extent of phosphorylation of DesR determines its binding capacity, and (ii) unphosphorylated DesR is unable to bind to its target promoter. It should be mentioned that when DesRD54A was incubated with 50 mm Ac-P, and then subjected to high performance liquid chromatography, we detected that a secondary site(s) of the protein was phosphorylated (data not shown). Nevertheless, as shown in Supplemental Materials Fig. S2A, phosphorylation of this secondary site was unable to stimulate DesRD54A binding to Pdes. DesR Is a Dimer in Solution and Tetramerizes upon Phosphorylation—Phosphorylation promotes the formation of dimers or even oligomers of many response regulators; however, other response regulators do not change their association state upon phosphorylation (23Jeon Y. Lee Y. Han J. Kim J. Hwang D. J. Biol. Chem. 2001; 276: 40873-40879Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (74) Google Scholar, 24Lewis R. Scott D. Brannigan J. Ladds J. Cervin M. Spiegelman G. Hogget J. Barák I. Wilkinson A. J. Mol. Biol. 2002; 316: 235-245Crossref PubMed Scopus (1) Google Scholar, 25Wyman C. Rombel I. North A. Bustamente C. Kustu S. Science. 2000; 275: 1658-1661Crossref Scopus (209) Google Scholar, 26Da Re S. Schumacher J. Rousseau P. Fourment J. Ebel C. Kahn D. Mol. Microbiol. 1999; 34: 504-511Crossref PubMed Scopus (89) Google Scholar). The existence of two DesR-P·DNA complexes (Figs. 1 and 2) indicates that phosphorylation of DesR favors the binding of more than one subunit of the protein to the des promoter. To study the association state of DesR or DesR-P, we performed sedimentation equilibrium experiments by analytical ultracentrifugation. In the case of DesR-P it was necessary to define the required experimental conditions to stabilize the phosphorylated form during the course of the sedimentation assay. Because the half-life of DesR-P at 25 °C is about 90 min (13Albanesi D. Mansilla M.C. de Mendoza D. J. Bacteriol. 2004; 186: 2655-2663Crossref PubMed Scopus (84) Google Scholar), a high steady state of phosphorylation was maintained in situ by the inclusion of an excess of Ac-P in the sample subjected to analytical ultracentrifugation. Ultracentrifugation runs were performed either with unphosphorylated DesR or with DesR-P at concentrations in the range of 1 to 12 μm. Unphosphorylated DesR behaved as a dimer in solution at every tested concentration, because all the experimental data fit the Sednterp predicted curve for a dimer (Supplemental Materials Fig. S3A). When DesR was subjected to analytical ultracentrifugation in the presence of Ac-P, its hydrodynamic behavior changed considerably, especially at the highest protein concentration, at which the tetramer became the most abundant species (Supplemental Materials Fig. S3B), although the best fit includes constants for higher order multimers. This suggests that phosphorylation of DesR promotes new interaction between DesR dimers. Plots of the buoyant molecular mass versus protein concentration (1–12 μm) indicated that at low protein concentrations, the molecular mass of DesR-P corresponded to a dimer (Supplemental Materials Fig. S3C). As the levels of DesR-P increased, the mass of the species became larger, reaching the mass of a tetramer. This is a characteristic behavior of a system in equilibrium; otherwise dilution would not affect the average molecular mass of the species. To confirm the hydrodynamic properties of DesR obtained by analytical ultracentrifugation and to investigate the tetramerization phenomenon in the absence of continuous phosphorylation by Ac-P, we resort to static light scattering experiments. To this end, solutions of unphosphorylated DesR or DesR incubated with Ac-P were dialyzed for 20 min to remove the phosphorylating agent. Then, the total scattered intensity at 90° was examined. The average molecular weight of DesR was 41,553, and that of DesR-P was 71,834, corresponding to 1.94 and 3.36 units of DesR, respectively. The latter fractional number suggested that in this condition phosphorylation with Ac-P does not reach completion, and that about 70% of DesR was phosphorylated on this sample. Control experiments with DesRD54A showed an average molecular weight corresponding to a dimer regardless of the Ac-P treatment. Taken together, these experiments demonstrated that DesR is a dimer in solution that mainly forms tetramers upon phosphorylation. High-resolution Contacts of DesR on Its Target—Previous DNase I footprinting assays have shown that DesR binds to a DNA sequence that extends from positions –28 to –77 relative to the des transcription start site, generating 5 protected regions on each strand (6Aguilar P.S. Hernandez-Arriaga A.M. Cybulski L.E. Erazo A.C. de Mendoza D. EMBO J. 2001; 20: 1681-1691Crossref PubMed Scopus (304) Google Scholar). Two inverted repeats (5′-TCAT-3′) separated by 9 nucleotides were found in the center of the protected region. To obtain a high resolution profile of the contacts between DesR-P and its target DNA we resorted to

ينظم مسار Des للعصية الرقيقة تخليق الإنزيم المرتبط بالغشاء الناجم عن الصدمة الباردة Δ 5 - fatty acid desaturase (Δ 5 - Des). أحد المكونات المركزية لمسار DES هو منظم الاستجابة، DesR، الذي يتم تنشيطه بواسطة كيناز مرتبط بالغشاء، DesK، استجابة لانخفاض سيولة الدهون في الغشاء. على الرغم من الدراسات الجينية والكيميائية الحيوية، لا تزال التفاصيل المحددة للتفاعل بين DesR والحمض النووي غير معروفة. في هذه الدراسة، نظهر أن الشكل الفوسفوري للبروتين DesR هو الوحيد القادر على الارتباط بمنطقة تنظيمية على الفور في المنبع من المروج لجين Δ 5 - Des (Pdes). يعزز فسفرة المجال التنظيمي لـ DesR ثنائي الأبعاد، بطريقة تعاونية، الاحتلال الهرمي لموقعين متجاورين وغير متطابقين لربط الحمض النووي لـ DesR - P، بحيث يكون هناك تحول في التوازن نحو الشكل النشط الرباعي لمنظم الاستجابة. بعد ذلك، يؤدي انتشار إشارة الفسفرة هذه إلى تنشيط جين DES من خلال تجنيد بوليميراز الحمض النووي الريبي إلى PDES. هذا هو المثال الأول المشرح لعامل النسخ الذي يعمل كمفتاح منشط بالفسفرة لجين الصدمة الباردة، مما يسمح للخلية بتحسين سيولة الدهون الفوسفورية الغشائية. ينظم مسار Des للعصية الرقيقة تخليق الإنزيم المرتبط بالغشاء الناجم عن الصدمة الباردة Δ 5 - fatty acid desaturase (Δ 5 - Des). أحد المكونات المركزية لمسار DES هو منظم الاستجابة، DesR، الذي يتم تنشيطه بواسطة كيناز مرتبط بالغشاء، DesK، استجابة لانخفاض سيولة الدهون في الغشاء. على الرغم من الدراسات الجينية والكيميائية الحيوية، لا تزال التفاصيل المحددة للتفاعل بين DesR والحمض النووي غير معروفة. في هذه الدراسة، نظهر أن الشكل الفوسفوري للبروتين DesR هو الوحيد القادر على الارتباط بمنطقة تنظيمية على الفور في المنبع من المروج لجين Δ 5 - Des (Pdes). يعزز فسفرة المجال التنظيمي لـ DesR ثنائي الأبعاد، بطريقة تعاونية، الاحتلال الهرمي لموقعين متجاورين وغير متطابقين لربط الحمض النووي لـ DesR - P، بحيث يكون هناك تحول في التوازن نحو الشكل النشط الرباعي لمنظم الاستجابة. بعد ذلك، يؤدي انتشار إشارة الفسفرة هذه إلى تنشيط جين DES من خلال تجنيد بوليميراز الحمض النووي الريبي إلى PDES. هذا هو المثال الأول المشرح لعامل النسخ الذي يعمل كمفتاح منشط بالفسفرة لجين الصدمة الباردة، مما يسمح للخلية بتحسين سيولة الدهون الفوسفورية الغشائية. يجب على جميع الكائنات الحية التواصل مع بيئتها للبقاء على قيد الحياة. تراقب الخلايا البكتيرية الظروف الخارجية وتعالج هذه المعلومات لإعطاء الاستجابة الأنسب. برزت الأنظمة التنظيمية المكونة من عنصرين كنموذج للاستجابات التكيفية. في أبسط أشكاله، يحتوي النظام ثنائي المكونات على مستشعر (هيستيدين كيناز) ومنظم استجابة (غالبًا ما يكون منشطًا نصيًا) (1Hoch J.A. Curr. الرأي. Microbiol. 2000 ؛ 3: 165-170 Crossref PubMed Scopus (632) Google Scholar). تؤدي التغييرات في البيئة إلى فسفرة المستشعر متبوعًا بنقل الفسفرة إلى منظم الاستجابة (1Hoch J.A. Curr. الرأي. Microbiol. 2000; 3: 165-170 Crossref PubMed Scopus (632) Google Scholar, 2Fabret C. Feher V.A. Hoch J.A. J. Bacteriol. 1999 ؛ 181: 1975-1983 الباحث العلمي في كروسريف بوبمد جوجل). على الرغم من أنه تم الإبلاغ في كثير من الأحيان عن أزواج منظم استجابة الكيناز من هذا النوع كحكام لمجموعة واسعة من المسارات استجابة لعدد لا يحصى من الإشارات (3Bourret R. Borkovich K. Simon M. Annu. Rev. Biochem. 1991; 60: 401-441 Crossref PubMed Scopus (390) Google Scholar, 4Stock J. Surette M. Levit M. Park P. Hoch J. Silhavy T. Two Component Signal Transduction. الجمعية الأمريكية لعلم الأحياء الدقيقة، واشنطن، D. C.1995: 25-51 الباحث العلمي من Google، 5Stock A. Robinson V. Goudreau P. Annu. Rev. Biochem. 2000; 69: 183-215 Crossref PubMed Scopus (2431) Google Scholar)، تم اكتشاف متطلبات هذا النظام للتحكم في التعبير الجيني أثناء الصدمة الباردة مؤخرًا في Bacillus subtilis (6Aguilar P.S. Hernandez - Arriaga AM Cybulski L.E. Erazo A.C. de Mendoza D. EMBO J. 2001; 20: 1681-1691 Crossref PubMed Scopus (304) Google Scholar) والبكتيريا الزرقاء (7Suzuki I. Los D.A. Kanesaki Y. Mikami K. Murata N. EMBO J. 2000; 19: 1327-1334 Crossref PubMed Scopus (219) Google Scholar). الصدمة الباردة هي حالة إجهاد تؤثر سلبًا على نمو الكائنات الحية المتقلبة الحرارة، مثل البكتيريا والنباتات. وبالتالي، فإن فهم الآليات التي تدرك بها هذه الكائنات إشارات درجة الحرارة المنخفضة وتنقل هذه المعلومات إلى الآلية الخلوية لتنشيط الاستجابات التكيفية له أهمية أساسية في علم الأحياء. يجب على البكتيريا ومعظم الكائنات الحية (إن لم يكن جميعها) إعادة تشكيل تركيبة الدهون في الغشاء للبقاء على قيد الحياة في درجات حرارة منخفضة. B. subtilis (6Aguilar P.S. Hernandez - Arriaga AM Cybulski L.E. Erazo A.C. de Mendoza D. EMBO J. 2001; 20: 1681-1691 Crossref PubMed Scopus (304) Google Scholar) و Synechocystis (7Suzuki I. Los D.A. Kanesaki Y. Mikami K. Murata N. EMBO J. 2000; 19: 1327-1334 Crossref PubMed Scopus (219) Google Scholar) تستجيب لانخفاض في درجة حرارة النمو المحيطة من خلال إدخال روابط مزدوجة في سلاسل الأسيل من الدهون الفوسفاتية الغشائية الخاصة بهم عن طريق إزالة تشبع الأسييل الدهني المرتبط بالغشاء. يبدو أن هذا التعديل اللاحق للتركيب لسلاسل الأسيل المشبعة مصمم لتحسين تأثير تغيرات درجة الحرارة على الحالة الفيزيائية للدهون الفوسفورية الغشائية. في Synechocystis وجد أن تعطيل اثنين من كيناز الهيستيدين يخفف من تحريض درجة الحرارة المنخفضة للجينات المشفرة لـ Δ 6 و ω -3 desaturase (7Suzuki I. Los D.A. Kanesaki Y. Mikami K. Murata N. EMBO J. 2000; 19: 1327-1334 Crossref PubMed Scopus (219) Google Scholar). ومع ذلك، لم يتم تحديد منظمات النسخ لهذه الجينات بعد. من الأمثلة المفهومة بشكل أفضل لإدراك ونقل إشارات درجة الحرارة المنخفضة هو مسار Des لـ B. subtilis، الذي ينظم التعبير عن نازعة تشبع شحوم الأسيل، Δ 5 - Des. يستجيب هذا المسار لانخفاض درجة حرارة النمو من خلال تعزيز التعبير عن الترميز الجيني لـ Δ 5 - Des (8Aguilar P.S. Cronan Jr.J.E. de Mendoza DJ Bacteriol. 1998 ؛ 180: 2194-2200 Crossref PubMed Google Scholar، 9Aguilar P.S. Lopez P. de Mendoza DJ Bacteriol. 1999 ؛ 181: 7028-7033 Crossref PubMed Google Scholar، 10Díaz A. Mansilla M.C. Vila A. de Mendoza DJ Biol. Chem. 2002; 277: 48099-48106Abstract full text full text PDF PubMed Scopus (58) Google Scholar, 11Altabe S. Aguilar P. Caballero G. de Mendoza DJ Bacteriol. 2003 ؛ 185: 3228-3231 Crossref PubMed Scopus (66) الباحث العلمي من Google). يتم التحكم في مسار DES بشكل فريد وصارم من قبل النظام المكون من مكونين، DesK/DesR (6Aguilar P.S. Hernandez - Arriaga AM Cybulski L.E. Erazo A.C. de Mendoza D. EMBO J. 2001 ؛ 20: 1681-1691 Crossref PubMed Scopus (304) Google Scholar). DesK هو كيناز الهيستيدين الموجود في الغشاء و DesR هو منظم استجابة سيتوبلازمية 22.18 - kDa يرتبط على وجه التحديد بمنطقة المعزز التي يتحكم فيها. تم تصنيف منظمي الاستجابة وفقًا لأوجه التشابه في مجال ربط الحمض النووي. ينتمي DesR إلى مجموعة NARL، حيث يحتوي مجال ربط C - terminal على زخرفة لولبية حلزونية (2Fabret C. Feher V.A. Hoch J.A. J. Bacteriol. 1999 ؛ 181: 1975-1983 الباحث العلمي في كروسريف بوبمد جوجل). بناءً على نموذج النظام ثنائي المكونات وعلى العمل السابق، اقترحنا أن يتواصل البروتينان عبر سلسلة من تفاعلات الفسفرة ونقل الفوسفات. يستشعر DesK انخفاضًا في سيولة الدهون في الغشاء ويتم فسفرته تلقائيًا بواسطة ATP داخل الخلايا في His -188 (12Cybulski L. Albanesi D. Mansilla M.C. Altabe S. de Mendoza D. Mol. Microbiol. 2002; 45: 1379-1388 Crossref PubMed Scopus (98) Google Scholar, 13Albanesi D. Mansilla M.C. de Mendoza DJ Bacteriol. 2004 ؛ 186: 2655-2663 Crossref PubMed Scopus (84) الباحث العلمي من Google). لقد أثبتنا مؤخرًا أن DesK - P قادر على فسفرة DesR (13 Albanesi D. Mansilla M.C. de Mendoza DJ Bacteriol. 2004 ؛ 186: 2655-2663 Crossref PubMed Scopus (84) الباحث العلمي من Google) لذلك اقترحنا أن هذا التعديل التساهلي لـ DesR يسمح بتفاعله مع المنطقة التنظيمية لـ DES، مما يؤدي إلى تنشيط نسخ DES. استند هذا الافتراض إلى حقيقة أنه لم يتم العثور بعد على أي منظم استجابة بكتيرية نشط في الشكل غير الفوسفوري، على الرغم من أن بعض منظمات الاستجابة، مثل الخميرة SSK1 I، غير نشطة في الشكل الفوسفوري (14Posas F. Saito H. EMBO J. 1998 ؛ 17: 1385-1394 Crossref PubMed Scopus (249) Google Scholar). على الرغم من أن الدراسات الجينية أظهرت أن DesR ضروري للغاية للتعبير عن DES، إلا أنه من غير المعروف ما إذا كان DesR قادرًا على تحفيز النسخ في حد ذاته أو أنه مطلوب لتحفيز تخليق أو نشاط عامل آخر ضروري لنسخ DES. في هذه الدراسة، درسنا كيف يؤثر الفسفرة على قدرة DesR على الارتباط بمروج DES (Pdes). 1 الاختصارات المستخدمة هي: Pdes، معزز DES ؛ RNAP، بوليميراز RNA ؛ EMSA، اختبار التحول الحركي الكهربي ؛ AC - P، فوسفات الأسيتيل ؛ CI و CII، المجمعات I و II ؛ RA و RB، المناطق A و B ؛ DR، التكرار المباشر. 1 الاختصارات المستخدمة هي: Pdes، معزز DES ؛ RNAP، بوليميراز RNA ؛ EMSA، اختبار التحول الحركي الكهربي ؛ AC - P، فوسفات الأسيتيل ؛ CI و CII، المجمعات I و II ؛ RA و RB، المناطق A و B ؛ DR، التكرار المباشر. تظهر نتائجنا أن الشكل الفوسفوري من DesR، DesR - P، هو الوحيد القادر على الارتباط بالمنطقة التنظيمية التي يسيطر عليها. بالإضافة إلى ذلك، نوضح أن DesR هو دايمر في المحلول الذي يميل إلى تتراميريز عند الفسفرة، والذي يمكن أن يفسر التفاعل التعاوني بين جزيئات DesR - P المرتبطة في مواقع الارتباط التنظيمي DesR المجاورة في Pdes. نظهر أن DesR - P ينشط نسخ DES من خلال توظيف بوليميراز RNA (RNAP) إلى مروج DES. ظهر نموذج للتعرف على معزز DesR - P من نتائجنا التي نناقشها في سياق التنظيم النصي لتوازن سيولة الغشاء. السلالات البكتيرية والبلازميد والسلالات - يتم سرد السلالات البكتيرية المستخدمة في هذا العمل في جدول المواد التكميلية I. تم فحص β - Galactosidase كما هو موضح سابقًا (15Mansilla C. de Mendoza DJ Bacteriol. 1997 ؛ 179: 76-981 الباحث العلمي من Google). لتحوير التكرار المقلوب لـ IR - L للمناطق التي كانت محمية في تجارب البصمة (الشكل 4)، تم استخدام الأوليجو نوكليوتيدات الأول والثاني والثالث والرابع لتضخيم اثنين من تفاعل البوليميراز المتسلسل المتداخل (انظر جدول المواد التكميلية الثاني). تم استخدام خليط من منتجات تفاعل البوليميراز المتسلسل هذه كقالب للحمض النووي لـ تفاعل البوليميراز المتسلسل آخر باستخدام أوليجو نوكليوتيدات I و VII (16 هورتون ر. هانت هـ. هو س. بولين ج. بيز ل. جين (Amst.). 1989 ؛ 77: 61-68 Crossref PubMed Scopus (2634) الباحث العلمي من Google). تم استنساخ منتج التضخيم 301 - bp في المتجه التكاملي pJM116 (17Dartois V. Dérbarbouillé F. Kunst F. Rapaport G. J. Bacteriol. 1998 ؛ 180: 1855-1861 Crossref PubMed Google Scholar) لإنشاء pLC118. لتحور IR - R، تم استخدام الأوليجو نوكليوتيدات V و VI بدلاً من II و III، وكان البلازميد الناتج هو pLC119. تم إدخال هذه البلازميدات في موضع amyE للسلالة JH642 مما يعطي السلالات LC118 و LC119، على التوالي. تم استخدام نفس الاستراتيجية لتحوير موقع الفسفرة المفترض Asp -54 باستخدام ALA، باستخدام oligonucleotides VIII و IX و X و XI. تم استنساخ منتج التضخيم في البلازميد pGS791 2G. شوجمان، التواصل الشخصي. تحت مروج الزيلوز، مما أسفر عن البلازميد plLC90. تم دمج هذا البلازميد خارج الرحم في موضع thC لسلالة B. subtilis التي تفتقر إلى DesR وتحتوي على اندماج جين مراسل lacZ إلى مروج DES (AKP9، انظر المرجع. 6Aguilar P.S. Hernandez - Arriaga A.M. Cybulski L.E. Erazo A.C. de Mendoza D. EMBO J. 2001; 20: 1681-1691 Crossref PubMed Scopus (304) Google Scholar) مما أسفر عن سلالة LC90. تم تضخيم النوع البري desR باستخدام الأوليجو نوكليوتيدات VIII و XI، وتم استنساخه بنفس طريقة desRD54A، مما أعطى سلالة LC89. تم تسلسل جميع البلازميدات لتأكيد إدخال الطفرات. تم تحضير شظايا الحمض النووي بما في ذلك النوع البري أو متغيرات محفز DES المختلفة بواسطة PCR باستخدام البرايمر XIII(PECO895) و VII(BAMO) (جدول المواد التكميلية II). تم إجراء الفحص كما هو موضح سابقًا (6Aguilar P.S. Hernandez - Arriaga AM Cybulski L.E. Erazo A.C. de Mendoza D. EMBO J. 2001 ؛ 20: 1681-1691 Crossref PubMed Scopus (304) Google Scholar). عندما تم استخدام DesR الفوسفوري في التفاعل، تم تحضين 6 ميكرومتر DesR لمدة 20 دقيقة عند 0 درجة مئوية في خليط يحتوي على 50 مم Tris - HCl، الرقم الهيدروجيني 8، 5 مم MgCl2، 0.5 مم EDTA، 1.25 مم dithiothreitol، 10 ٪ جلسرين، و 50 مم أسيتيل فوسفات. بالنسبة للتكوين المعقد الثلاثي، تم تحضير شظية الحمض النووي باستخدام التمهيديين الرابع عشر والخامس عشر (جدول المواد التكميلية الثاني). تمت إضافة إنزيم RNAP Holoenzyme (Epicenter) عند 100 نانومتر وحضنته لمدة 30 دقيقة عند 25 درجة مئوية قبل تشغيل الجل. عندما تم تضمين الهيبارين في التفاعل، تمت إضافته لمدة 5 دقائق، عند 60 ميكروغرام/مل، بعد الحضانة باستخدام RNAP. OH• فحوصات البصمة - تم إجراء علاج جذري للهيدروكسيل بشكل أساسي كما هو موضح (18del Solar G.H. Pérez - Martin J. Espinosa M. J. Biol. Chem. 1990; 265: 12569-12575 Abstract Full Text PDF PubMed Google Scholar). يحتوي خليط التفاعل النموذجي على 2.6 نانومتر 5'- جزء الحمض النووي المسمى بالنهاية يمتد من –167 إلى +10 بالنسبة لموقع بدء النسخ، DesR - P (300 أو 1000 نانومتر)، 25 مم Tris - HCl، الرقم الهيدروجيني 8، 1 مم dithiothreitol، 0.25 مم EDTA، 4 مم MgCl2، و 200 نانوغرام من البولي(dI - dC). بعد الحضانة لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة، تمت إضافة أسكوربات الصوديوم 1 مم، H2O2 إلى 0.03 ٪، و Fe(EDTA)2 - (التركيزات النهائية 18 و 36 ميكرومتر لـ Fe(II) و Na2EDTA، على التوالي)، واستمرت الحضانة لمدة دقيقة واحدة عند نفس درجة الحرارة. تم إيقاف التفاعلات عن طريق إضافة محلول الثيوريا/EDTA (التركيزات النهائية 9.5 مم من الثيوريا و 1.7 مم من EDTA). تم تشغيل الخلطات في هلام بولي أكريلاميد غير قابل للتبديل بنسبة 5 ٪. تعرض الجل لفيلم تصوير إشعاعي ذاتي لمدة 5 دقائق، وتم قطع المجمعات I و II من الجل. تم تصفية الحمض النووي وترسيبها وتحميلها على مواد هلامية متسلسلة من البولي أكريلاميد بنسبة 8 ٪، وتم تشغيلها جنبًا إلى جنب مع منتجات تفاعلات التسلسل لماكسام وجيلبرت (G + A) التي تم الحصول عليها من نفس الحمض النووي المسمى. تم تصور نمط الشريط باستخدام جهاز تصوير فوسفوري من فوجي فيلم. تم حقن فصل DesR من DesR - P - DesR أو DesR الفوسفوريلات في المختبر مع فوسفات الأسيتيل (AC - P) لمدة 20 دقيقة على عمود Vydac للمرحلة العكسية C4، باستخدام كروماتوغراف سائل ÄKTA. كان Eluent A 0.1 ٪ حمض ثلاثي فلورو أسيتيك، 20 ٪ أسيتونيتريل في الماء ؛ كان Eluent B 0.1 ٪ حمض ثلاثي فلورو أسيتيك، 60 ٪ أسيتونيتريل في الماء. تم شطف العينة بتدرج يتراوح من 80 إلى 0 ٪ A، أكثر من 40 دقيقة. بدأ Eluent B بنسبة 20 ٪ وذهب إلى 100 ٪ خلال نفس الفترة. كان معدل التدفق 1 مل/دقيقة. تم إجراء دراسات الطرد المركزي الفائق التحليلي - الطرد المركزي الفائق التحليلي في Beckman XL - A (Beckman Instruments Inc.) المجهزة بنظام بصري مرئي للأشعة فوق البنفسجية داخل جهاز الطرد المركزي الدقيق. تم إجراء تجارب توازن الترسيب عند 12000 دورة في الدقيقة و 20 درجة مئوية في القطع المركزية ذات ثماني قنوات من Epon مع تركيزات تحميل البروتين في نطاق 1–12 ميكرومتر. تمت موازنة DesR في محلول عازل يحتوي على 50 مم Tris - HCl، ودرجة الحموضة 8، و 5 مم MgCl2، و 0.5 مم EDTA، و 0.1 مم dithiothreitol (و 50 مم AC - P عند الحاجة). تم إجراء مسح الامتصاص الشعاعي عند 231 و 275 و 280 نانومتر بعد الوصول إلى توازن الترسيب. تم تحديد إزاحة خط الأساس عن طريق الطرد المركزي عالي السرعة (42000 دورة في الدقيقة). تم تحليل البيانات التجريبية باستخدام برنامج Sednterp الإصدار 1.03 XLAEQ و EQASSOC (Beckman; 19Laue T.M. Shah B.D. Ridgeway T.M. Pelletier S.L. Harding S.E. Rowe A.J. Horton J.C. Ultracentrifugation التحليلي في الكيمياء الحيوية وعلوم البوليمر. الجمعية الملكية للكيمياء، كامبريدج 1992: 90-125 الباحث العلمي من Google، 20Minton A.P. Schuster T.M. Laue T.M. الطرد المركزي التحليلي الحديث. Birkhauser، Boston، MA1994: 81-93 Crossref Google Scholar)، باستخدام حجم محدد جزئي لـ DesR قدره 0.7449 مل g -1. تم تحديد هذه القيمة على أساس تركيبة بقايا الأحماض الأمينية. تم حساب قيم معاملات الانقراض عند 280 نانومتر من محتويات بقايا التريبتوفان والتيروزين المعروفة. تحديد الوزن الجزيئي لـ DesR بواسطة تشتت الضوء الثابت - تم تحديد متوسط الوزن الجزيئي (Mr) من النوع البري DesR و DesRD54A الطافر المعالج وغير المعالج بـ AC - P على أداة تشتت الضوء PD2010 الكاشف الدقيق المتصلة جنبًا إلى جنب بنظام كروماتوغرافي سائل عالي الأداء ومقياس انكسار تفاضلي LKB 2142. تم تحميل العينات على عمود Sephadex G -25 (1 مل) وتم تصفيتها باستخدام 50 مم Tris - HCl، pH 8، 0.3 م NaCl، 0.5 مم dithiothreitol، بمعدل تدفق 0.3 مل/دقيقة. تم تسجيل إشارات تشتت الضوء ومؤشر الانكسار بزاوية 90درجة للمادة المرشحة على جهاز كمبيوتر شخصي وتم تحليلها باستخدام برنامج Discovery32 الذي توفره Precision Detector. تمت معايرة كاشف تشتت الضوء بزاوية 90درجة باستخدام ألبومين مصل الأبقار (66.5 كيلو دالتون) كمعيار. فحوصات النسخ في المختبر - تم إجراء تفاعلات النسخ في المختبر (50 ميكرولتر) في منطقة عازلة تحتوي على 40 مم Tris - HCl و pH 8 و 10 نانومتر MgCl2 و 150 مم KCl و 0.1 مم EDTA و 5 ٪ جلسرين. تم تحضير جزء من الحمض النووي يمتد من الموضع -177 إلى الموضع +43 بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل باستخدام أوليجو نوكليوتيدات PA و PC (الجدول التكميلي II). تم حضانة الحمض النووي (5 نانومتر) أولاً باستخدام DesR - P (300 نانومتر) لمدة 20 دقيقة عند 25 درجة مئوية، ثم 10 دقائق باستخدام RNAP (0.2 وحدة) عند نفس درجة الحرارة. ثم تمت معالجة الخليط بـ 10 ميكروغرام/مل من الهيبارين لمدة 3 دقائق عند 37 درجة مئوية. بدأت التفاعلات بإضافة 5 ميكرولتر من محلول 2 متر من NTPs الأربعة التي تحتوي على 0.5 ميكرومتر [α -32P]UTP (400 Ci/mmol ؛ 10 μCi/μl). بعد 5 دقائق من الحضانة عند 37 درجة مئوية، تم إنهاء التفاعل بإضافة أسيتات الصوديوم، ودرجة الحموضة 7، إلى 300 مم، و EDTA إلى 15 مم، و tRNA إلى 100 ميكروغرام/ميكرولتر، وتم ترسيب الأحماض النووية بإضافة 250 ميكرولتر من الإيثانول بنسبة 100 ٪. تم تجزئة المنتجات عن طريق الرحلان الكهربائي على 8 ٪ هلام بولي أكريلاميد يحتوي على 8 م يوريا. تمثل معادلة حساب ثابت التفكك النسبي لمجمعات الحمض النووي المنظم I و II - KdI و KdII ثوابت التفكك للمجمعات المحددة I و II، على التوالي. يمثل fmaxCI المستوى الأقصى الكسري للمركب I الذي تم تحقيقه في التفاعلات (21Tsai S. Tsai M. O'Malley B. Cell. 1989 ؛ 57: 443-448 ملخص النص الكامل PDF PubMed Scopus (194) الباحث العلمي من Google). DNA+DesR⇄KdICI⇄↘KdIIDesRCII (المعادلة 1) KdIKdII=[1fmaxCI−1]2(المعادلة 2) يزيد فسفرة DesR من تقارب الارتباط بالحمض النووي المستهدف - أردنا فحص كيفية تأثير الفسفرة على قدرة DesR على الارتباط بمنطقة الحمض النووي التي تمتد عبر Pdes بواسطة مقايسات إزاحة الحركة الكهربي (EMSA) باستخدام DesR أو DesR - P، وهذا الأخير الفسفوريل في المختبر مع AC - P. تحقيقا لهذه الغاية، تم تحضين جزء من الحمض النووي 216 - bp المسمى بـ PCR [α -32P] dATP والذي يمتد من المواضع -187 إلى +29، بالنسبة لموقع بدء نسخ DES، مع DesR أو DesR - P. وأظهرت النتائج أن Pdes أظهرت تغيرات في حركتها الكهربي في وجود إما DesR (الشكل 1A) أو DesR - P (الشكل 1B )؛ ومع ذلك، عندما تم استخدام DesR - P، كانت تركيزات البروتين المنخفضة كافية للحصول على نفس الجزء من الحمض النووي المعقد. أظهر DESR الفسفوريلي ارتباطًا بمحفز DES بتركيزات منخفضة تصل إلى 0.06 ميكرومتر. عند هذا التركيز، لوحظ بشكل أساسي وجود مركب مهاجر سريع I (CI). عززت زيادة تركيز DesR - P تدريجيًا تكوين المركب II البطيء الهجرة (CII ؛ الشكل 1B). عند 0.6 ميكرومتر، من الواضح أن CII هو مركب البروتين- الحمض النووي السائد. اقترح تشكيل مركبين مختلفين، CI و CII، وجود موقعين ملزمين لمنظم الاستجابة. كان DesR بدون علاج AC - P قادرًا أيضًا على الارتباط بـ Pdes، ولكن كانت هناك حاجة إلى تركيزات أعلى لتشكيل CI و CII (الشكل 1 أ). أشار موقع فسفرة DesR هو Asp -54 - تحليل مقارن للتسلسل لمنظمات الاستجابة البكتيرية باستخدام محاذاة تسلسل متعددة مع التجميع الهرمي (Multalin) إلى أن Asp -54 من DesR يجب أن يكون البقايا التي تتلقى مجموعة الفوسفوريل من الكيناز المشابه، DesK. لتحديد ما إذا كان موقع الفسفرة المفترض هذا، Asp -54، متورطًا في نشاط DesR، تم استبداله بـ ALA باستخدام الطفرات الموجهة للموقع. تم توفير شظايا الحمض النووي التي تحمل إما desR + (النوع البري) أو desR التي تشفر البروتين الطافر (desRD54A) في صورة متحولة إلى طفرة خالية من desR تحمل اندماجًا لجين مراسل lacZ إلى محفز DES. سمح التعبير عن النوع البري desR+ بتحفيز نسخ des عند خفض درجة الحرارة، في حين أن التعبير عن desRD54A لا يمكن أن يحفز نسخ اندماج des - lacZ في ظل نفس الظروف (شكل المواد التكميلية. S1)، مما يشير إلى أن بقايا Asp -54 أمر بالغ الأهمية لنشاط النسخ في الجسم الحي DesR. وتأكيدًا لهذا الاستنتاج، قررنا أن DesK الفسفوريل الذاتي يعمل بمثابة فسفودونور للبروتين المستجيب DesR، ولكن لا يمكن نقل مجموعة الفوسفوريل إلى DesRD54A (البيانات غير معروضة). الشكل غير الفوسفوري لـ DESR غير قادر على الارتباط بمنظم استجابة DES مثل B. subtilis PhoP يرتبط بالمروجين المستهدفين إما في الشكل غير الفوسفوري أو في الشكل الفوسفوري. ومع ذلك، فإن الشكل غير الفوسفوري من PhoP غير قادر على تنشيط النسخ (22Liu W. Hulett M. J. Bacteriol. 1997 ؛ 179: 6302-6310 Crossref PubMed Google Scholar). كما هو موضح في الشكل 1A، يرتبط DesR بـ Pdes حتى بدون علاج سابق بـ AC - P، على الرغم من التجارب في الجسم الحي (الموصوفة في شكل المواد التكميلية. S1) إلى أن فسفرة أسب-54 أمر بالغ الأهمية لنشاط الحد من مخاطر الكوارث. هذا يشير إلى أن DesR تصرفت بشكل مشابه لـ PhoP. إذا كان هذا هو الحال، يجب أن يرتبط DesRD54A بـ Pdes في EMSA، بنفس طريقة DesR غير الفسفوري، ولكن يجب ألا تزيد معالجة DesRD54A بـ AC - P من تقاربها الملزم. لتقييم هذا الاحتمال، تم اختبار ربط DesRD54A المنقى بـ Pdes باستخدام EMSA. من المثير للدهشة أن DesRD54A لم يتمكن من الارتباط بـ Pdes بأي تركيز تم اختباره حتى عند معالجته بـ AC - P (شكل المواد التكميلية. S2A). يمكن أن تعزى هذه النتيجة إلى: (1) الشكل غير الفوسفوري لـ DesR لا يرتبط بـ Pdes، ونشاط الربط الملاحظ في التجربة الموضحة في الشكل 1 أ بسبب الفسفرة غير المحددة لـ DesR أثناء الإفراط في إنتاجه في الإشريكية القولونية، أو (2) تسببت الطفرة النقطية Asp - Ala في DesRD54A في تغيير شكلي ألغى ربط منظم الاستجابة المتحور بـ Pdes. للتمييز بين هذين الاحتمالين، تم إخضاع DesR المنقى من E. coli لكروماتوغرافيا سائلة عالية الأداء في المرحلة العكسية (شكل المواد التكميلية. S2B). أظهر DesR قمتين تتوافقان مع الشكل الفسفوريلي وغير الفسفوريلي للمنظم. عندما تم تحضين DesR المستخرج من E. coli مع AC - P، زادت الذروة المقابلة لـ DesR - P بشكل كبير (شكل المواد التكميلية. S2C). تشير هذه النتيجة إلى أن حوالي 50 ٪ من DesR الموسوم المنقى من E. coli يتم فسفرته، وأن هذا النموذج يمكن أن يكون مسؤولاً عن نشاط ربط DesR دون معالجة AC - P في فحوصات EMSA الموضحة في الشكل. 1 أ. تجدر الإشارة إلى أن تحليل ثنائية اللون الدائري أظهر أن DesRD54A يقدم نفس الهيكل الثانوي العالمي مثل النوع البري DesR (شكل المواد التكميلية. S2D)، مما يدعم الاستنتاج بأن هذا المنظم الطافر لا يرتبط بـ Pdes لأنه غير قادر على الفسفرة في الأسبارتات المحفوظة بواسطة AC - P، بدلاً من التغيير الهيكلي الناتج عن الطفرة. لإثبات مباشرة أن الشكل غير الفوسفوري لـ DesR لا يرتبط بمروجها المستهدف، استفدنا من الملاحظة القائلة بأن DesR - P يتم نزع الفسفوريل تمامًا بعد الحضانة عند 25 درجة مئوية لمدة 12 ساعة (13 Albanesi D. Mansilla M.C. de Mendoza DJ Bacteriol. 2004 ؛ 186: 2655-2663 Crossref PubMed Scopus (84) الباحث العلمي من Google). اختبرنا من قبل EMSA تأخر Pdes في وجود DesR غير المعالج (لأنه يزيل من عمود حمض النيكل والنيتريلوتريسيتيك)، DesR dephosphorylated by incubation at 25 ° C for 12 h، أو DesR dephosphorylated at 25 ° C and phosphorylated again by treatment with Ac - P. Fig. يوضح 2A أن DesR غير المعالج يشكل مركبين (الممرات 2–4)، في حين أن DesR منزوع الفسفوريل عند 25 درجة مئوية غير قادر على الارتباط بـ Pdes (الممرات 5–7). كما هو متوقع، عندما تم تحضين DesR غير الفوسفوري هذا بـ AC - P، استعاد نشاط ربط الحمض النووي (الممرات 8–10). من الآن فصاعدًا، سنطلق على "DesR غير الفوسفوري" البروتين الذي تم تحضينه لمدة 12 ساعة عند 25 درجة مئوية. بالإضافة إلى ذلك، أدى حضانة DesR غير الفوسفوري مع تركيزات متزايدة من AC - P إلى تعزيز مماثل لربط منظم الاستجابة، ليصل إلى 50 مم كحد أقصى من متبرع الفوسفوريل (الشكل 2 ب). من النتائج المذكورة أعلاه، يمكننا استخلاص استنتاجين: (1) مدى فسفرة DesR يحدد قدرته على الربط، و (2) DesR غير الفسفوري غير قادر على الارتباط بالمروج المستهدف. تجدر الإشارة إلى أنه عندما تم تحضين DesRD54A بـ 50 مم AC - P، ثم تم إخضاعه لكروماتوغرافيا سائلة عالية الأداء، اكتشفنا أن موقعًا(مواقع) ثانويًا للبروتين تم فسفرته (لم يتم عرض البيانات). ومع ذلك، كما هو موضح في شكل المواد التكميلية. S2A، لم تتمكن فسفرة هذا الموقع الثانوي من تحفيز ارتباط DesRD54A بـ Pdes. DesR عبارة عن دايمر في المحلول و Tetramerizes on Phosphorylation - Phosphorylation يعزز تكوين الدايمرات أو حتى الأوليجومرات للعديد من منظمي الاستجابة ؛ ومع ذلك، فإن منظمي الاستجابة الآخرين لا يغيرون حالة ارتباطهم عند الفسفرة (23Jeon Y. Lee Y. Han J. Kim J. Hwang DJ Biol. Chem. 2001; 276: 40873-40879Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (74) Google Scholar, 24Lewis R. Scott D. Brannigan J. Ladds J. Cervin M. Spiegelman G. Hogget J. Barák I. Wilkinson A. J. Mol. Biol. 2002; 316: 235-245 Crossref PubMed Scopus (1) Google Scholar, 25Wyman C. Rombel I. North A. Bustamente C. Kustu S. Science. 2000 ؛ 275: 1658-1661 Crossref Scopus (209) الباحث العلمي من Google، 26Da Re S. Schumacher J. Rousseau P. Fourment J. Ebel C. Kahn D. Mol. Microbiol. 1999 ؛ 34: 504-511 Crossref PubMed Scopus (89) الباحث العلمي من Google). يشير وجود معقدين للحمض النووي DesR - P (الشكلان 1 و 2) إلى أن فسفرة DesR تفضل ربط أكثر من وحدة فرعية واحدة من البروتين بمحفز DES. لدراسة حالة ارتباط DesR أو DesR - P، أجرينا تجارب توازن الترسيب عن طريق الطرد المركزي التحليلي. في حالة DesR - P، كان من الضروري تحديد الظروف التجريبية المطلوبة لتثبيت الشكل الفسفوريلي أثناء فحص الترسيب. لأن عمر النصف لـ DesR - P عند 25 درجة مئوية حوالي 90 دقيقة (13 Albanesi D. Mansilla M.C. de Mendoza DJ Bacteriol. 2004 ؛ 186: 2655-2663 Crossref PubMed Scopus (84) Google Scholar)، تم الحفاظ على حالة ثابتة عالية من الفسفرة في الموقع من خلال تضمين فائض من AC - P في العينة الخاضعة للطرد المركزي التحليلي. تم إجراء عمليات الطرد المركزي الفائق إما مع DesR غير الفوسفوري أو مع DesR - P بتركيزات تتراوح من 1 إلى 12 ميكرومتر. تصرف DesR غير الفوسفوري كدايمر في المحلول عند كل تركيز تم اختباره، لأن جميع البيانات التجريبية تتناسب مع منحنى Sednterp المتوقع للدايمر (شكل المواد التكميلية. S3A). عندما تعرض DesR للطرد المركزي التحليلي الفائق في وجود AC - P، تغير سلوكه الهيدروديناميكي بشكل كبير، خاصة عند أعلى تركيز للبروتين، حيث أصبح الرباعي أكثر الأنواع وفرة (شكل المواد التكميلية. S3B)، على الرغم من أن أفضل ملاءمة تتضمن ثوابت لأجهزة التعددية ذات الترتيب الأعلى. يشير هذا إلى أن فسفرة DesR تعزز تفاعلًا جديدًا بين دايمرات DesR. أشارت مخططات الكتلة الجزيئية الطافية مقابل تركيز البروتين (1–12 ميكرومتر) إلى أنه عند تركيزات البروتين المنخفضة، تتوافق الكتلة الجزيئية لـ DesR - P مع دايمر (شكل المواد التكميلية. S3C). مع زيادة مستويات DesR - P، أصبحت كتلة الأنواع أكبر، ووصلت إلى كتلة رباعي. هذا سلوك مميز لنظام في حالة توازن ؛ وإلا فإن التخفيف لن يؤثر على متوسط الكتلة الجزيئية للأنواع. لتأكيد الخصائص الهيدروديناميكية لـ DesR التي تم الحصول عليها عن طريق الطرد المركزي التحليلي وللتحقق من ظاهرة الرباعية في غياب الفسفرة المستمرة بواسطة AC - P، نلجأ إلى تجارب تشتت الضوء الساكن. ولتحقيق هذه الغاية، تم غسيل محاليل DesR غير الفوسفوري أو DesR المحتضنة بـ AC - P لمدة 20 دقيقة لإزالة عامل الفسفرة. ثم تم فحص الشدة الإجمالية المتناثرة عند 90درجة. كان متوسط الوزن الجزيئي لـ DesR 41,553، وكان متوسط الوزن الجزيئي لـ DesR - P 71,834، أي ما يعادل 1.94 و 3.36 وحدة من DesR، على التوالي. اقترح العدد الكسري الأخير أنه في هذه الحالة لا تصل الفسفرة مع AC - P إلى الاكتمال، وأن حوالي 70 ٪ من DesR تم فسفرتها في هذه العينة. أظهرت تجارب التحكم مع DesRD54A متوسط الوزن الجزيئي المقابل للدايمر بغض النظر عن علاج AC - P. أظهرت هذه التجارب مجتمعة أن DesR هو دايمر في المحلول الذي يشكل بشكل أساسي رباعي الترامر عند الفسفرة. أظهرت اتصالات DESR عالية الدقة في فحوصات بصمة DNase I السابقة المستهدفة أن DESR يرتبط بتسلسل الحمض النووي الذي يمتد من المواضع –28 إلى –77 بالنسبة لموقع بدء نسخ DES، مما يولد 5 مناطق محمية على كل خيط (6Aguilar P.S. Hernandez - Arriaga AM Cybulski L.E. Erazo A.C. de Mendoza D. EMBO J. 2001 ؛ 20: 1681-1691 Crossref PubMed Scopus (304) Google Scholar). تم العثور على اثنين من التكرارات المقلوبة (5'- TCAT -3 ') مفصولة بـ 9 نيوكليوتيدات في وسط المنطقة المحمية. للحصول على صورة عالية الدقة للاتصالات بين DesR - P والحمض النووي المستهدف، لجأنا إلى