[ES] La vida posnatal temprana es una ventana crítica para la programación del desarrollo. Durante este periodo, la nutrición puede inducir marcas epigenéticas persistentes. Estas marcas pueden influir en la expresión génica, el metabolismo, la función inmunitaria y los caracteres productivos en etapas posteriores de la vida. En el ovino lechero, el periodo de lactancia es especialmente importante para las corderas de reposición. Este periodo coincide con un rápido crecimiento y con el desarrollo posnatal de los ovocitos. Por tanto, los cambios nutricionales durante esta etapa pueden afectar al animal tratado, definido como generación F0, y también pueden ejercer efectos intergeneracionales sobre su descendencia, definida como generación F1. La metionina es un aminoácido esencial. También participa en el metabolismo de un carbono. A través de esta vía, la metionina contribuye a la síntesis de S-adenosilmetionina, el principal donador de grupos metilo utilizado en la metilación del ADN. Por esta razón, la metionina puede conectar la nutrición temprana con las marcas epigenéticas y con la regulación a largo plazo de la expresión génica. El objetivo general de esta tesis fue determinar si la suplementación con metionina durante el periodo de lactancia de corderas Assaf de reposición induce efectos persistentes en las hembras F0 y si estos efectos se transmiten a la descendencia F1. Treinta y cuatro corderas Assaf recién nacidas fueron asignadas a dos grupos. El grupo control recibió un lactoreemplazante comercial ad libitum. El grupo suplementado recibió el mismo lactoreemplazante enriquecido con 1 g de D,L-metionina/kg de materia seca hasta el destete. Después del destete, todos los animales F0 fueron manejados bajo las mismas condiciones. En la madurez, las ovejas F0 fueron inseminadas para obtener la generación F1. Este diseño experimental permitió evaluar los efectos directos en las ovejas F0 y los efectos intergeneracionales en hembras y machos F1. La tesis se desarrolló a través de cuatro estudios conectados. El primer estudio evaluó los efectos a largo plazo de la suplementación posnatal temprana con metionina en corderas F0. Se centró en la eficiencia alimentaria, la producción de leche, el perfil de ácidos grasos de la leche, el metabolismo, el microbioma intestinal y la regulación epigenética. La suplementación con metionina no mejoró el crecimiento, la eficiencia alimentaria ni la producción de leche en las ovejas F0. Sin embargo, indujo cambios metabólicos persistentes y marcas epigenéticas específicas. Se detectaron un total de 146 sitios CpG diferencialmente metilados, asociados con 67 genes. Entre ellos, ATP6AP1 y CPT1B mostraron metilación diferencial tanto en regiones promotoras como en el cuerpo génico. RFLNB, LTO1, DIAPH2, KIF4A y PDZD11 mostraron metilación diferencial en regiones promotoras. Estos genes están relacionados con el metabolismo lipídico, el transporte iónico, el desarrollo óseo y la regulación celular. Estos resultados sugieren que la suplementación temprana con metionina modificó la regulación biológica en las ovejas F0, principalmente a través de mecanismos epigenéticos, más que mediante una mejora directa del rendimiento productivo. El segundo estudio examinó los exosomas derivados del calostro de ovejas F0 y sus posibles efectos sobre la función de barrera intestinal en la generación F1. Para ello, se utilizó un modelo 3D de co-cultivo en transwell de organoides intestinales ovinos y macrófagos. La suplementación con metionina en las corderas F0 modificó el perfil de microARN de los exosomas del calostro producidos durante la edad adulta de las F0. Dos microARN, oar_miR_376c_3p y oar_miR_432, estuvieron regulados a la baja en los exosomas procedentes de ovejas F0-MET. Estos exosomas no modificaron significativamente la expresión génica de marcadores de barrera intestinal, incluidos TJAP1 y OCLN. Tampoco afectaron significativamente la expresión de genes inmunitarios de macrófagos, como TNF-α, IL-10 y TGF-β. Sin embargo, redujeron la secreción de IL-12 por los macrófagos. Por tanto, el principal efecto no fue una mejora directa de la expresión génica relacionada con la barrera intestinal, sino una posible modulación de la respuesta inflamatoria. Este hallazgo relaciona la suplementación temprana con metionina en animales F0 con posibles efectos funcionales sobre la salud intestinal de la generación F1. El tercer estudio investigó los efectos intergeneracionales de la suplementación temprana con metionina sobre las hembras F1. Estas hembras F1 nacieron de ovejas F0 control o de ovejas F0 suplementadas con metionina. El estudio evaluó el crecimiento, la eficiencia alimentaria, la producción de leche, la composición de la leche, el metabolismo, la microbiota intestinal y la metilación del ADN durante la primera lactación. Las hembras F1 procedentes de madres F0-MET mostraron menor peso vivo y una tendencia a menor producción de leche. También presentaron cambios en indicadores metabólicos, incluidos la insulina y el β-hidroxibutirato. Su perfil de ácidos grasos de la leche se modificó, con mayores proporciones de ácidos grasos poliinsaturados. El análisis de metilación del ADN mostró marcas epigenéticas intergeneracionales en las hembras F1. Estas marcas estuvieron enriquecidas en vías relacionadas con el desarrollo, la formación de estructuras anatómicas, la morfogénesis celular, la neurogénesis y el desarrollo axonal. Algunas regiones diferencialmente metiladas también se asociaron con genes implicados en el metabolismo lipídico, incluidos CPT1B y CYP2J. Estos resultados indican que la suplementación con metionina durante el periodo de lactancia de las corderas F0 puede inducir efectos intergeneracionales en la descendencia femenina F1. El cuarto estudio evaluó los efectos intergeneracionales de la suplementación con metionina en F0 sobre los corderos machos F1. Estos machos F1 fueron estudiados durante el periodo de cebo y en relación con los caracteres de calidad de la carne. La suplementación materna con metionina no afectó significativamente la ingestión de alimento, la tasa de crecimiento, la eficiencia alimentaria, la fermentación ruminal, la composición química de la carne, el perfil de ácidos grasos de la carne ni los compuestos volátiles. Sin embargo, la carne de los machos F1-MET mostró mayor índice de rojo y mayor dureza. Estos resultados sugieren que la suplementación temprana con metionina en ovejas F0 no mejoró el rendimiento productivo de los machos F1, pero sí modificó caracteres específicos de calidad de la carne. Este efecto podría estar relacionado con marcas epigenéticas intergeneracionales que afectan a vías implicadas en el desarrollo muscular y del tejido conectivo. En conjunto, esta tesis muestra que la suplementación con metionina durante el periodo de lactancia de corderas Assaf de reposición produce efectos biológicos duraderos. Estos efectos fueron más evidentes a nivel de marcas epigenéticas, regulación metabólica, perfil de ácidos grasos de la leche, respuesta inflamatoria, función de barrera intestinal y calidad de la carne que a nivel de rendimiento productivo. Los resultados también muestran que algunas respuestas se transmitieron desde las ovejas F0 a la descendencia F1. Por tanto, la suplementación posnatal temprana con metionina puede actuar como un factor de programación nutricional. Sin embargo, su uso práctico en corderas de reposición debe evaluarse cuidadosamente, ya que los efectos dependieron del carácter estudiado y no siempre fueron beneficiosos.

[EN] Early postnatal life is a critical window for developmental programming. During this period, nutrition may induce persistent epigenetic marks. These marks can influence gene expression, metabolism, immune function, and productive traits later in life. In dairy sheep, the suckling period is especially important for replacement ewe lambs. It coincides with rapid growth and postnatal oocyte development. Therefore, nutritional changes during this stage may affect the treated animal, defined as the F0 generation, and may also have intergenerational effects on its offspring, defined as the F1 generation. Methionine is an essential amino acid. It is also involved in one-carbon metabolism. Through this pathway, methionine contributes to the synthesis of S-adenosylmethionine, the main methyl donor used in DNA methylation. For this reason, methionine may connect early nutrition with epigenetic marks and long-term regulation of gene expression. The general aim of this thesis was to determine whether methionine supplementation during the suckling period of Assaf replacement ewe lambs induces persistent effects in F0 females and whether these effects are transmitted to F1 offspring. Thirty-four newborn Assaf ewe lambs were assigned to two groups. The control group received a commercial milk replacer ad libitum. The supplemented group received the same milk replacer enriched with 1 g D,L-methionine/kg dry matter until weaning. After weaning, all F0 animals were managed under the same conditions. At maturity, F0 ewes were inseminated to obtain the F1 generation. This experimental design allowed the evaluation of direct effects in F0 ewes and intergenerational effects in F1 females and males. The thesis was developed through four connected studies. The first study evaluated the long-term effects of early postnatal methionine supplementation in F0 ewe lambs. It focused on feed efficiency, milk yield, milk fatty acid profile, metabolism, gut microbiome, and epigenetic regulation. Methionine supplementation did not improve growth, feed efficiency, or milk yield in F0 ewes. However, it induced persistent metabolic changes and specific epigenetic marks. A total of 146 differentially methylated CpG sites associated with 67 genes were detected. Among them, ATP6AP1 and CPT1B showed differential methylation in both promoter and gene body regions. RFLNB, LTO1, DIAPH2, KIF4A, and PDZD11 showed differential methylation in promoter regions. These genes are related to lipid metabolism, ion transport, bone development, and cellular regulation. These results suggest that early methionine supplementation modified biological regulation in F0 ewes, mainly through epigenetic mechanisms, rather than through direct improvement of productive performance. The second study examined colostrum-derived exosomes from F0 ewes and their possible effects on intestinal barrier function in the F1 generation. This study used 3D ovine intestinal organoid–macrophage transwell co-culture model. Methionine supplementation in F0 ewe lambs modified the microRNA profile of colostrum exosomes produced during F0 adulthood. Two microRNAs, oar_miR_376c_3p and oar_miR_432, were downregulated in exosomes from F0-MET ewes. These exosomes did not significantly modify the gene expression of intestinal barrier markers, including TJAP1 and OCLN. They also did not significantly affect the expression of macrophage immune genes such as TNF-α, IL-10, and TGF-β. However, they reduced IL-12 secretion by macrophages. Therefore, the main effect was not a direct improvement of intestinal barrier gene expression, but a possible modulation of inflammatory response. This finding links early methionine supplementation in F0 animals with potential functional effects on F1 intestinal health. The third study investigated the intergenerational effects of early methionine supplementation on F1 female offspring. These F1 females were born from F0 control or F0 methionine-supplemented ewes. The study evaluated growth, feed efficiency, milk production, milk composition, metabolism, gut microbiota, and DNA methylation during first lactation. F1 females from F0-MET dams showed lower body weight and a tendency toward lower milk yield. They also showed changes in metabolic indicators, including insulin and β-hydroxybutyrate. Their milk fatty acid profile was modified, with higher proportions of polyunsaturated fatty acids. DNA methylation analysis showed intergenerational epigenetic marks in F1 females. These marks were enriched in pathways related to development, anatomical structure formation, cell morphogenesis, neurogenesis, and axon development. Some differentially methylated regions were also associated with genes involved in lipid metabolism, including CPT1B and CYP2J. These results indicate that methionine supplementation during the suckling period of F0 ewe lambs can induce intergenerational effects in F1 female offspring. The fourth study evaluated the intergenerational effects of F0 methionine supplementation on F1 male lambs. These F1 males were studied during the fattening period and for meat quality traits. Maternal methionine supplementation did not significantly affect feed intake, growth rate, feed efficiency, ruminal fermentation, meat chemical composition, meat fatty acid profile, or volatile compounds. However, meat from F1-MET males showed higher redness but greater hardness. These results suggest that early methionine supplementation in F0 ewes did not improve productive performance in F1 males, but it modified specific meat quality traits. This effect may be related to intergenerational epigenetic marks affecting pathways involved in muscle and connective tissue development. Overall, this thesis shows that methionine supplementation during the suckling period of Assaf replacement ewe lambs produces long-lasting biological effects. These effects were more evident at the level of epigenetic marks, metabolic regulation, milk fatty acid profile, inflammatory response, , and meat quality than at the level of productive performance. The results also show that some responses were transmitted from F0 ewes to F1 offspring. Therefore, early postnatal methionine supplementation can act as a nutritional programming factor. However, its practical use in replacement ewe lambs should be evaluated carefully, because the effects were trait-dependent and were not always beneficial.

This work was funded by Ministerio de Ciencia e Innovación (PID2021-126489OB-100 MCIN/AEI/10.13039/501100011033, "FEDER, una manera de hacer Europa"). Alba Martín gratefully acknowledges receipt of a pre-doctoral grant (PRE2019-089288) from Ministerio de Ciencia e Innovación (MCIN/AEI/10.13039/501100011033, El FSE invierte en tu futuro". The metabolomics analysis was carried out at the UNI-TECH "OMICS" platforms of the Universitas degli Studi di Milano. We acknowledge Dr. Manuela Fontana's necessary support from the UNI-TECH "OMICS" platforms of the Universitas degli Studi di Milano. CENSYRA (León, Spain) is also gratefully acknowledged for milk analyses. Also, it was supported by grant PID2020-119035RB-100 funded by MICIN/AEI/10.13039/501100011033. G. Galli received grant PRE2021-096909 funded by MCIN/AEI/10.13039/501100011033 and by "ESF Investing in your future".

Dehnavi, M.; Martín, A.; Mateo, J.; Madsen, O.; Giráldez, F.J.; Ceciliani, F.; De Vos, J.; Biscarini, F.; Faré, F.; Cremonesi, P.; Ghaffari, M.H.; Santos, N.; Andrés, S. (2025). Early post-natal methionine supplementation in ewe lambs: long-term effects on feed efficiency, milk yield and fatty acid profile, metabolism, gut microbiome, and epigenetic regulation Animal Feed Science and Technology, 321: 116245. Elsevier. https://doi.org/10.1016/j.anifeedsci.2025.116245

Dehnavi, M.; Martín, A.; Mateo, J.; Giráldez, F.J.; Ceciliani, F.; Biscarini, F.; Cremonesi, P.; Faré, F.; Santos, N.; López, S.; Andrés, S. (2026). Methionine supplementation during early post-natal life of ewe lambs: Developmental programming of the female offspring and effects on the first lactation Animal Feed Science and Technology, 333: 116640. Elsevier https://doi.org/10.1016/j.anifeedsci.2026.116640

Dehnavi, M.; Galli, G.; García-Estrada, C.; Balaña-Fouce, R.; Giráldez, F.J.; Alonso, M.; Santos, N.; Rozada, F.; Andrés, S. (2025). An ovine intestinal organoid-macrophage co-culture model to test the effects of ovine colostrum exosomes on intestinal barrier function and inflammation International Journal of Molecular Sciences, 26(23): 11406. MDPI. https://doi.org/10.3390/ijms262311406

Dehnavi, M.; Mateo, J.; Martín, A.; Giráldez, F.J.; Caro, I.; Morán, L.; Andrés, S. (2025). The early methionine supplementation of ewe lambs (F0) modifies meat quality traits of the progeny (F1, male fattening lambs) Animals, 15(9): 1290. MDPI. https://doi.org/10.3390/ani15091290

Tesis doctoral de la Universidad de León y el Instituto de Ganadería de Montaña (IGM-CSIC). Leída el 22-06-2026

Peer reviewed