Finalmente, a través de la metodología de secuenciación masiva, estudiamos la participación de miRNAs, endo-siRNAs y piRNAs en la singamia y la formación cigótica. Encontramos una elevada expresión de endo-siRNAs y piRNAs en ovocito y cigoto, que contrasta con la baja representatividad relativa de la población de miRNAs respecto a la totalidad de RNAs de pequeño tamaño. Así como los miRNAs regulan postranscripcionalmente la expresión de genes mediante unión a las regiones 3´UTR de los mensajeros y bloqueando su traducción, las poblaciones de endo-siRNAs y piRNAs se asocian a elementos transponibles (ETs) del genoma. Su papel en la regulación negativa de estos ETs, es fundamental para proteger el genoma de la libre inserción de estos elementos móviles en la línea germinal, y por nuestros datos también en cigoto. Además algunos endo-siRNAs pueden sobre mRNAs regulando postranscripcionalmente la expresión de genes de modo similar a los miRNAs. Esta función de algunos endo-siRNAs podría estar mediada por Ago2, cuyo nivel de expresión se incrementa en etapas previas a la compactación morular, sugiriendo una posible activación de los endo-siRNAs en situaciones celulares en las que el procesamiento de miRNAs podría estar bloqueado, como hemos descrito anteriormente. Hemos podido detectar la expresión específicamente cigótica tanto de piRNAs como de endo-siRNAs.

Analizamos mediante RT-qPCR la expresión de los genes que codifican proteínas claves en la biogénesis de los miRNAs: Drosha, Dgcr8, Dicer, Xpo5 y Ago1-5 (oficialmente Eif2c1-5). Observamos una progresiva reducción de la expresión de estos genes tras la fecundación, a excepción de Ago2, que incrementando su expresión en etapas post-cigóticas, parece tener un papel clave en este periodo del desarrollo. Estos resultados corroborarían la hipótesis establecida sobre la limitada función de los miRNAs desde ovocito hasta blastocisto. Sin embargo cuantificando por “arrays” de baja densidad los valores de expresión de 231 miRNAs, y analizando miRNAs específicos en todas sus formas precursoras (pri-microRNAs y pre-microRNAs) y maduras (miRNA), podemos concluir que durante el desarrollo preimplantacional existen mecanismos alternativos de generación de miRNA que posibilitan la disponibilidad de formas maduras de miRNAs, con funciones claves en el progreso y la diferenciación embrionaria (como los de la familia miR-290-295), en ausencia de elementos canónicos de la biogénesis de miRNAs. Es decir, existiría una regulación negativa o eliminación de los componentes reguladores de la biogénesis de miRNAs y una regulación positiva de los alternativos.

Paralelamente parecen operar sistemas de eliminación selectiva de miRNAs mediante el marcaje de algunas de sus formas precursoras a través de mecanismos conocidos bajo el término de “edición” de RNA. Hemos comprobado que dichos mecanismos, mediados por las proteínas de la familia ADAR, actúan durante las etapas de desarrollo preimplantacional, regulando la biogénesis de dos miRNAs específicos: miR-151-3p y miR-99b. La eliminación de los miRNAs “editados” podría llevarse a cabo mediante la proteína Tudor-SN. En este trabajo hemos detectado su elevada expresión en ovocito y cigoto y su localización celular. En las últimas etapas del desarrollo preimplantacional observamos su acumulación en gránulos citoplasmáticos conspicuos, que hemos denominado “cuerpos T”, y que no se asocian con otros dominios citoplasmáticos de eliminación de RNA como son los “cuerpos-P”.

Los RNAs de pequeño tamaño, son elementos claves en la regulación postranscripcional de la expresión génica durante el desarrollo y diferenciación de organismos eucariotas. La embriogénesis preimplantacional es una fase clave y altamente regulada en la vida de los mamíferos. Dentro de los RNAs de pequeño tamaño, los miRNAs, los endo-siRNAs y los piRNAs, han sido objeto de estudio en el presente trabajo. En ratón (Mus musculus) como modelo, hemos caracterizado las etapas de la biogénesis y expresión de miRNAs desde ovocito hasta blastocisto y extendido este análisis a endo-siRNAs y piRNAs en las etapas de ovocito y cigoto por su importancia en el inicio de un organismo pluricelular.

Respecto a los miRNAs el análisis por secuenciación masiva demuestra la existencia de una gran variedad de modificaciones en la secuencia para cada miRNA definido como “canónico”. Esas modificaciones afectan a la secuencia nucleotídica de los miRNA y también a la longitud de dichas secuencias. Estos resultados pueden abrir nuevas vías de interpretación y análisis en el papel de miRNAs asociados a desarrollo, diferenciación o patogenia, ya que la proporción de formas “variantes” es mayor que la de canónicas, para la mayoría de los miRNAs identificados.

El presente trabajo se ha financiado a través de los siguientes proyectos: MICINN (BFU2004-03977/BFI); MICINN (Instituto de Salud Carlos III) (PI071007);CSIC(PIE-CSIC201020E016);CEFIC-LRi

viii,270 págs.

Peer reviewed