[ES] El xilano es el tipo de hemicelulosa más abundante en la naturaleza y uno de los componentes principales de la biomasa vegetal. Está formado por una cadena principal de D-xilopiranosas, unidas por enlace β-(1,4) O-glicosídico, y diferentes cadenas laterales que pueden contener α-L-arabinosa, ácido α-D-glucurónico, α-4-O-metil-D-glucurónico, ácido ferúlico o grupos acetilo. La hidrólisis del xilano ocurre mediante la acción sinérgica y coordinada de las xilanasas, enzimas pertenecientes a diferentes familias de glicosil hidrolasas (GHs) que actúan sobre enlaces glicosídicos entre dos carbohidratos o entre un carbohidrato y un aglicón. Dentro de las xilanasas, destacan las endoxilanasas, que hidrolizan los enlaces β-(1,4) del interior de la cadena principal del xilano, liberando xilooligosacáridos, y las β-xilosidasas, que completan el proceso de degradación hasta xilosa. Además de su capacidad hidrolítica, algunas GHs, son capaces de catalizar reacciones de transglicosilación, uniendo azúcares a distintas moléculas aceptoras. Los rendimientos de estas reacciones de síntesis son generalmente bajos, pero pueden incrementarse mediante el desarrollo de variantes glicosintasas y tioglicoligasas de estas enzimas. El hongo ascomiceto Talaromyces amestolkiae secreta una amplia batería de GHs (incluidas xilanasas) que pueden aplicarse en distintos procesos biotecnológicos. Además, su genoma y secretoma revelan que existen muchas más enzimas de este tipo que aún están por estudiar. En este contexto, el objetivo general de esta Tesis Doctoral fue caracterizar y mejorar una nueva endoxilanasa, perteneciente a la familia GH10, así como aumentar la producción de xilanasas en este hongo mediante su manipulación genética. En el Capítulo 1 se localizó el gen de la nueva endoxilanasa GH10 en el genoma del T. amestolkiae y se expresó en la levadura Pichia pastoris. La proteína recombinante (XynSOS) se purificó y caracterizó, determinándose que es una enzima monomérica altamente glicosilada con una masa molecular de ~53 kDa y estable en un amplio rango de pH (de 2,2 a 8). Los estudios cinéticos confirmaron su alta afinidad por xilano de haya y arabinoxilano de trigo. Esta capacidad se aprovechó para producir xilooligosacáridos de bajo grado de polimerización, considerados prebióticos emergentes. rXynSOS también fue capaz de catalizar reacciones de transglicosilación, aunque con bajas eficiencias. Por ello, se desarrolló una variante glicosintasa sustituyendo el residuo catalítico nucleófilo E236 por glicina (rXynSOSE236G), que mostró una actividad de síntesis considerablemente superior a la de la enzima nativa, glicosilando un amplio abanico de compuestos fenólicos con propiedades bioactivas. En el Capítulo 2 la glicosintasa rXynSOSE236G se utilizó para glicosilar resveratrol, un polifenol con actividad antioxidante y numerosos beneficios para la salud, cuya aplicación está muy limitada por su baja solubilidad en agua y biodisponibilidad. La reacción de glicosilación dio lugar al 3-O-β-D-xilobiósido de resveratrol, como producto principal, y a otros glicósidos minoritarios. Optimizando las condiciones de reacción se consiguió alcanzar una conversión del 35% para este nuevo xilobiósido, el cual experimentó una impresionante mejora en su solubilidad (~5.000 veces). Esto podría facilitar su administración en dosis más elevadas, aunque pare ver su efecto sería necesario que se liberara el aglicón, un proceso que, en humanos, solo puede tener lugar en el colon, donde existen bacterias capaces de hidrolizar el enlace glicosídico entre la xilobiosa y el resveratrol. Un estudio preliminar, realizado con fermentaciones fecales, confirmó que la microbiota de colon es capaz de desglicosilar el 3-O-β-D-xilobiósido de resveratrol, lo que representa un primer paso para estudiar su posible acción terapéutica.

[EN] Xylan is the most abundant type of hemicellulose in nature and a major component of plant biomass. It consists of a backbone of D-xylopyranose units linked by β-(1,4) glycosidic bonds, substituted with various side chains including α-L-arabinose, α-D-glucuronic acid, α-4-O-methyl-D-glucuronic acid, ferulic acid and/or acetyl groups. Xylan hydrolysis is mediated by the synergistic and coordinated action of xylanases, enzymes belonging to different glycoside hydrolase (GH) families that cleave glycosidic bonds between two carbohydrates or between a carbohydrate and an aglycone. Among them, endoxylanases hydrolize internal β-(1,4) linkages within the xylan backbone, releasing xylooligosaccharides, while β-xylosidases complete the degradation process to xylose. Beyond their hydrolytic activity, some GHs can catalyze transglycosylation reactions, transferring sugars to different acceptor molecules. Although the yield of such synthetic reactions is generally low, it can be increased by engineering glycosynthase and thioglycoligase variants. The ascomycete fungus Talaromyces amestolkiae secretes a broad battery of GHs (including xylanases) with high potential for biotechnological applications. Moreover, genomic and secretomic analyses reveal the presence of many additional, yet uncharacterized, enzymes of this type. In this context, the overall aim of this PhD Thesis was to characterize and improve a novel GH10 endoxylanase, as well as to enhance xylanase production in this fungus through its genetic manipulation. Chapter 1 describes the identification of the gene encoding the novel GH10 endoxylanase in T. amestolkiae’s genome and its heterologous production in the yeast Pichia pastoris. The recombinant protein (rXynSOS) was purified and characterized as a monomeric enzyme with a molecular mass of ~53 kDa, high glycosylation levels, and stability across a wide pH range (2.2–8). Kinetic analyses showed high affinity for beechwood xylan and wheat arabinoxylan, enabling the production of low-degree of polymerization xylooligosaccharides with emerging prebiotic potential. rXynSOS was also capable of catalyzing transglycosylation reactions, although with low efficiency. To address this, a glycosynthase variant was developed by substituting the nucleophilic catalytic residue E236 with glycine (rXynSOSE236G). This novel glycosynthase exhibited markedly improved synthetic activity, glycosylating a wide range of bioactive phenolic compounds. In Chapter 2, the rXynSOSE236G glycosynthase was employed to glycosylate resveratrol, a polyphenol with antioxidant properties and numerous health benefits, but limited in application due to its low water solubility and bioavailability. The glycosylation reaction yielded 3-O-β-D-xylobiosyl resveratrol as the main product, along with minor glycosides. Optimization of reaction conditions resulted in a 35% conversion to this novel xylobioside, which showed a remarkable ~5,000-fold increase in solubility. This could enable higher dosage formulations; however, release of the aglycone is required, a process that in humans occurs only in the colon, where bacteria can hydrolyze the glycosidic bond between xylobiose and resveratrol. A preliminary study using fecal fermentations confirmed that colon microbiota can deglycosylate 3-O-β-D-xylobiosyl resveratrol, which respresents an initial step toward evaluating its potential therapeutic effects.

[ES] En el Capítulo 3 se logró, por primera vez, la modificación genética de T. amestolkiae mediante la transformación química de sus protoplastos y utilizando la complementación de auxotrofía para pirimidinas como marcador de selección. Para ello, fue necesario generar una cepa auxótrofa para pirimidinas mediante incubación en ácido 5-fluoroorótico (5-FOA), que induce mutaciones en los genes pyrG o pyrF, esenciales en la ruta de síntesis de novo de pirimidinas. La transformación del hongo permitió introducir con éxito un plásmido integrativo y otro de replicación autónoma, siendo este último empleado para obtener una cepa con fluorescencia roja y, en el siguiente capítulo, como herramienta para sobreexpresar casetes génicos. El Capítulo 4 abordó la mejora de la producción de xilanasas en T. amestolkiae mediante su manipulación genética. La sobreexpresión del gen del regulador XlnR, principal activador transcripcional del sistema xilanolítico en hongos filamentosos, incrementó las actividades β-xilosidasa y endoxilanasa en 1,4 y 2,0 veces, respectivamente, en comparación con la cepa silvestre, en cultivos con xilano. Sin embargo, se consiguieron mejores resultados al introducir las sustituciones Ala788Val o Val785Phe en XlnR. En particular, el mutante Tam_XlnRV785F alcanzó incrementos de 3,3 veces en la actividad β-xilosidasa y de 3,9 veces en la endoxilanasa. Además, esta cepa mejoró en gran medida la producción de estas enzimas utilizando residuos agroindustriales como el glicerol y el bagazo de cerveza. Tam_XlnRV785F también mostró una desregulación parcial del sistema xilanolítico, ya que en presencia de glucosa (condiciones no inductoras), se obtuvieron niveles más elevados de actividad β-xilosidasa (16,9 veces) y endoxilanasa (31,9 veces), en comparación con la cepa silvestre, en la que apenas se detectaron estas actividades. Este aumento de actividad xilanolítica se atribuyó a una mayor producción de las enzimas correspondientes, lo que permitió obtener mejores rendimientos de sacarificación de xilano de haya con los crudos de Tam_XlnRV785F que con los de la cepa silvestre. En conclusión, los estudios llevados a cabo en esta Tesis Doctoral corroboran el interés de T. amestolkiae como productor de xilanasas con gran potencial biotecnológico. Además de caracterizar una nueva endoxilanasa de este hongo, perteneciente a la familia GH10 y capaz de catalizar tanto reacciones de hidrólisis como de síntesis, se ha comprobado que el desarrollo de variantes glicosintasas a partir de ella permite glicosilar compuestos fenólicos bioactivos de manera más eficiente. En este sentido, cabe destacar que, por primera vez, se ha sintetizado enzimáticamente un xilobiósido de resveratrol, mucho más soluble que su aglicón y con posibles efectos beneficiosos para la salud. Por otra parte, se ha determinado que la manipulación genética y la modificación de factores de transcripción como XlnR, son herramientas muy prometedoras para incrementar la producción de xilanasas en T. amestolkiae, incluso en condiciones no inductoras. Todos estos resultados permitirán en un futuro aprovechar este hongo en diversas aplicaciones biotecnológicas para la valorización de residuos agroindustriales.

[EN] Chapter 3 reports the first successful genetic transformation of T. amestolkiae through protoplast-mediated chemical transformation, using uracil auxotrophy complementation as selection marker. In order to achieve this, an auxotrophic strain needed to be obtained by incubation with 5-fluoroorotic acid (5-FOA), which induces mutations in the pyrG or pyrF genes involved in the de novo pyrimidine biosynthesis pathway. Transformation of this fungus enabled the introduction of both integrative and autonomously replicating plasmids, the latter being used to generate a red fluorescent strain and, in the next chapter, as a tool to overexpress gene cassettes. Chapter 4 focuses on improving xylanase production in T. amestolkiae through its genetic manipulation. The overexpression of the gene encoding the XlnR regulator, the major transcriptional activator of the xylanolytic system in filamentous fungi, enhanced β-xylosidase and endoxylanase activities by 1.4- and 2.0-fold, respectively, compared to the wild-type strain, in xylan-containing cultures. Better results were achieved with the introduction of Ala788Val or Val785Phe substitutions in XlnR. Specifically, the Tam_XlnRV785F mutant reached 3.3-fold and 3.9-fold increases in β-xylosidase and endoxylanase activities, respectively. Additionally, this strain substantially improved the production of these enzymes using agro-industrial residues such as glycerol and beer bagasse. Tam_XlnRV785F also exhibited partial desregulation of the xylanolytic system, as under non-inducing conditions (glucose), much higher β-xylosidase (16.9-fold) and endoxylanase (31.9-fold) activities were obtained compared to the wild-type, in which these activities were barely detectable. This enhancement in xylanolytic activity was attributed to an increased production of the corrresponding enzymes, leding to better beechwood xylan saccharification yields with Tam_XlnRV785F crudes than with those from the wild-type. In conclusion, the research conducted in this PhD Thesis underscores the relevance of T. amestolkiae as a promising source of xylanases with high biotechnological potential. In addition to characterizing a new endoxylanase from this fungus, which belongs to the GH10 family and was capable of catalyzing both hydrolysis and synthesis reactions, we demonstrated that the development of glycosynthase variants from it allows for more efficient glycosylation of bioactive phenolic compounds. In this sense, a resveratrol xylobioside was enzymatically synthesized for the first time, exhibiting markedly improved solubility and potential health benefits. Furthermore, genetic manipulation and engineering of transcriptional regulators like XlnR proved to be effective strategies for enhancing xylanase production in T. amestolkiae, even under non-inducing conditions. All these findings pave the way for future biotechnological applications of this fungus in the valorization of agro-industrial residues.

Esta Tesis Doctoral ha sido realizada en el grupo Sistemas Microbianos e Ingeniería de Proteínas del Centro de Investigaciones Biológicas Margarita Salas, perteneciente al Consejo Superior de Investigaciones Científicas (CIB-CSIC). Ha sido financiada por una ayuda de Formación de Profesorado Universitario (FPU2019/04192) y los proyectos RTI2018-093683-B-I00 (GLYSUS) y H2V2021-05-003 (en el marco de la PTI+ TransEner). Agradecer también al Ministerio de Ciencia, Innovación y Universidades (MICIU) la financiación de la beca FPU de Ana y a la Federation of European Microbiological Societies (FEMS) la financiación de su estancia de investigación en el grupo Bioavailability del Helmholtz Centre for Environmental Research (UFZ, Leipzig, Alemania).

Tesis inédita de la Universidad Complutense de Madrid, Facultad de Ciencias Químicas.-- Programa de Doctorado en Bioquímica, Biología Molecular y Biomedicina.--Tesis con mención internacional

Peer reviewed