[ES]Los macrófagos pueblan todos los tejidos del organismo y son imprescindibles para su homeostasis. Los macrófagos muestran un espectro de fenotipos o estados de polarización que vienen determinados por numerosas moléculas y sustancias. Por lo tanto, los macrófagos son células extremadamente plásticas capaces de detectar su entorno y cambiar y responder en consecuencia. Durante la inflamación, los macrófagos ejercen funciones efectoras proinflamatorias y antiinflamatorias/resolutivas necesarias para el retorno a la homeostasis, y cuyo desequilibrio promueve o colabora en la etiología de enfermedades inflamatorias crónicas. Para simplificar el estudio de la polarización de los macrófagos el presente estudio se ha centrado en dos fenotipos opuestos: macrófagos proinflamatorios y antiinflamatorios. In vitro, podemos diferenciar monocitos de donantes de sangre a macrófagos utilizando GMCSF y M-CSF, respectivamente. La citoquina M-CSF induce la generación de macrófagos con perfil antiinflamatorio (IL10+++) e inmunosupresor (protumoral). Por contra, GM-CSF dispone a los macrófagos para la presentación de antígenos, la estimulación de linfocitos T (antitumoral) y una potente actividad proinflamatoria (TNF+++IL6+++). Por lo tanto, los macrófagos proinflamatorios (GM-MØ) y los macrófagos antiinflamatorios (M-MØ) equiparan el fenotipo in vivo de macrófagos sinoviales de pacientes con artritis reumatoide y de macrófagos asociados a tumores en pacientes con cáncer. En consecuencia, estos subtipos de macrófagos generados in vitro constituyen un modelo idóneo para estudiar el comportamiento de los macrófagos en diferentes escenarios. Además, a medida que la reprogramación de macrófagos se está estableciendo como una estrategia terapéutica, el conocimiento de las bases moleculares de la diferenciación de macrófagos y su (re)polarización se hace completamente necesario. Numerosas investigaciones han demostrado que GM-MØ y M-MØ muestran un transcriptoma completamente único y específico que determina su fenotipo, y que la modificación de este perfil se ve reflejada en su comportamiento funcional. Por lo tanto, el análisis del transcriptoma de macrófagos se puede utilizar para abordar el efecto de diferentes moléculas y receptores en su polarización. Los Receptores X Hepáticos (en inglés Liver X Receptors, LXR) son determinantes para la función de los macrófagos ya que controlan el eflujo del colesterol y el metabolismo de los lípidos, pero también la fagocitosis de células apoptóticas, la migración de células dendríticas y la diferenciación de macrófagos del bazo. Además, los LXR ejercen acciones antiinflamatorias y potencian la secreción de citoquinas, y presentan una mayor expresión en los macrófagos sinoviales y en los macrófagos asociados a tumores en condiciones patológicas. Las dos proteínas de la familia LXR, LXRα (gen NR1H3) y LXRβ (gen NR1H2), son factores de transcripción dependientes de ligando que regulan la expresión génica por lo que su estado de activación se puede manipular in vitro, lo que permite estudiar su papel fisiopatológico, analizar su contribución a la polarización y función de macrófagos humanos y evaluar su potencial terapéutico en enfermedades con un alto componente inflamatorio, como la artritis o el cáncer.

First, we analyzed the expression of LXR and their targets, as well as their basal level of activation, in both GM-MØ and M-MØ. Considering that LXR are expressed at high levels in both macrophages, we modulated LXR activity during monocyte to macrophage transition and analyzed the gene profile of fully differentiated macrophages. To that end, we treated monocytes with one dose of a potent agonist of LXR, GW3965, or a potent inverse agonist, GSK2033. In this manner, we determined that LXR nuclear receptors are essential for acquisition of the GM-MØ and M-MØ gene profile, and found that LXR activation promotes proinflammatory differentiation whereas LXR inactivation does the opposite. LXR activation also promoted higher pro- and antiinflammatory cytokine secretion but with a greater ratio of pro- vs antiinflammatory cytokines in a macrophage training-like scenario, where macrophages are primed for a second response upon TLR stimulation. On the other hand, LXR inactivation impeded an optimal production of pro- and antiinflammatory cytokines. We also analyzed antigen presentation to T Lymphocytes, methotrexate response and direct antitumoral capacity of macrophages as characteristic function that define the M-MØ or GMMØ phenotypes, and the overall results corroborated the transcriptomic analyses. Additionally, we found that LXR regulate MAFB expression, an important regulator of antiinflammatory polarization and also IRF4 and PPARγ expression, two factors that favors proinflammatory differentiation and activities. Besides, preliminary results suggest that MAFB could modulate the proinflammatory effects of LXR activation in M-MØ.To recapitulate these transcriptomic findings in a physiopathological scenario and determine if LXR modulation could constitute a therapeutic treatment, we studied the contribution of LXR to the proinflammatory effect of rheumatoid arthritis synovial fluids and the antiinflammatory effect of tumor-derived ascitic fluids. Results revealed that activation of LXR impaired the acquisition of antiinflammatory markers induced by ascitic fluid, and that LXR inactivation impeded the upregulation of proinflammatory genes in monocytes exposed to RA synovial fluids. Finally, we demonstrated that the proinflammatory effects that AhR inhibition exerted on human M-MØ were partially dependent on LXR, and that blocking of LXR impeded the acquisition of certain proinflammatory genes in M-MØ exposed to AhR inhibitors and abrogated AhR-influenced SREBP signaling. Considering all the results generated upon this thesis work, we can conclude that: 1) LXR nuclear receptors are essential for the in vitro differentiation of human monocyte-derived macrophages and exert a minor role in fully differentiated human macrophages, 2) LXR activation promotes a proinflammatory polarization in macrophages, and their inactivation promotes an antiinflammatory polarization state, 3) LXR activity determines the functional performance of human macrophages, 4) LXR control of macrophage differentiation and polarization might involve the participation of MAFB, IRF4 and PPARγ transcription factors and 5) LXR partially mediates the influence of AhR on the antiinflammatory polarization of human macrophages.

En primer lugar, hemos analizado la expresión de LXR y sus genes diana, así como su nivel basal de activación, en GM-MØ y M-MØ. Dada su elevada expresión en ambos tipos de macrófagos, determinamos el perfil génico de los macrófagos generados tras la exposición de monocitos a una dosis de un potente agonista de LXR, GW3965, o del potente agonista inverso GSK2033. De esta forma hemos determinado que los factores LXR son esenciales para la adquisición del perfil génico de GM-MØ y M-MØ, que la activación de LXR promueve la diferenciación proinflamatoria y que la inactivación de los LXR impulsa la diferenciación antiinflamatoria. De esta manera comprobamos también que la activación de LXR favorece una mayor ratio de secreción de citoquinas pro/antiinflamatorias, en un escenario que asemeja al “training” de macrófagos, y hemos puesto de manifiesto que los factores LXR modulan la presentación de antígenos a linfocitos T, la respuesta a metotrexato y la capacidad antitumoral de M-MØ y GM-MØ. De forma adicional hemos comprobado que los factores LXR regulan la expresión de MAF y MAFB, determinantes en la polarización antiinflamatoria y de los factores IRF4 y PPARγ, que favorecen actividades proinflamatorias. Los resultados posteriores sugieren que el factor MAFB podría contribuir a los efectos proinflamatorios de la activación de los LXR en M-MØ. Para recapitular estos hallazgos en escenarios fisiopatológicos y determinar si la modulación de los LXR podría plantearse como tratamiento terapéutico, hemos analizado el efecto de los factores LXR en la polarización proinflamatoria promovida por el líquido sinovial de pacientes con artritis reumatoide y en la polarización antiinflamatoria inducida por líquidos ascíticos tumorales. Nuestros resultados han revelado que la modulación de la actividad de LXR también es capaz de alterar la polarización inducida por ambos fluidos patológicos. Finalmente, hemos demostrado que los efectos proinflamatorios derivados de la inhibición crónica del Receptor de Aril-Hidrocarburos (en inglés, Aryl Hydrocarbon Receptor, AhR) son parcialmente dependientes de los factores LXR. El bloqueo de los receptores LXR impide la adquisición de algunos genes de la firma génica proinflamatoria promovida por la inhibición de AhR e inhibe el efecto que la inhibición de AhR tiene sobre los genes dependientes de los factores SREBP. Todos los resultados obtenidos nos permiten concluir que: 1) los receptores nucleares LXR son esenciales para la diferenciación de monocitos humanos a macrófagos in vitro y cumplen un rol minoritario en macrófagos ya diferenciados; 2) la activación de LXR promueve una polarización pro-inflamatoria, mientras que su inactivación favorece la adquisición de un estado de polarización anti-inflamatorio, y que ambos efectos se corroboran en presencia de fluidos biológios patológicos; 3) la actividad de LXR es determinante para el comportamiento funcional de macrófagos humanos; 4) los efectos de LXR en macrófagos implican la participación de otros factores de transcripción como MAFB, IRF4 y PPARγ; y 5) LXR participa de la capacidad del factor AhR de promover la polarización antiinflamatoria de macrófagos humanos.

[EN]Macrophages populate every tissue in the body, where are determinant to their homeostasis. To develop this crucial task, macrophages display a quasi-infinite spectrum of phenotypes or "polarization states", and these states are determined by tissue molecules and substances present in their immediate surroundings. Thus, macrophages are extremelyplastic cells capable of sensing and adapting to their environment. During inflammation, macrophages exert pro-inflammatory and anti-inflammatory/resolving effector functions, which are crucial for tissue injury removal and return to homeostasis, and whose unbalance promotes chronic inflammatory diseases. To simplify the study of macrophage polarization, we analyzed two extreme polarization states: proinflammatory and antiinflammatory macrophages. We differentiated monocytes in vitro from healthy blood donors to macrophages using GM-CSF and M-CSF, respectively. M-CSF primes macrophages for acquisition of an anti-inflammatory (IL10high) and immunosuppressive (protumoral) profile. GM-CSF is produced at sites of inflammation and primes macrophages for robust antigen-presenting, T cell-stimulatory (antitumoral) and pro-inflammatory activity (TNFhigh IL6high). Therefore, human proinflammatory macrophages (GM-MØ from now on) and human antiinflammatory macrophages (M-MØ from now on) resemble in vivo arthritis-related synovial macrophages and tumor associated macrophages, respectively. These in vitro macrophages constitute a powerful model to study the behavior of macrophages in different scenarios. Besides, as macrophage re-programming is being actively assessed as a therapeutic strategy for numerous inflammatory disorders, the knowledge of the molecular basis regulating macrophage differentiation and (re)polarization is absolutely required. Previous investigations have shown that GM-MØ and M-MØ display a unique and specific gene set signature that determines their phenotype, and that the modification of this gene profile reflects the functional performance of these macrophages. Consequently, analysis of macrophage transcriptome can be used to address the role of distinct molecular cues in macrophage polarization. The Liver X Receptors (LXR) are nuclear receptors that control macrophage function, mainly cholesterol efflux and lipid metabolism, but also phagocytosis of apoptotic cells, dendritic cell migration and splenic macrophage differentiation. Besides, LXR have recently been linked to inflammation as LXR exert anti-inflammatory actions and potentiate cytokine secretion and are also upregulated in synovial macrophages and in tumor associated macrophages in pathological conditions. The two proteins of the LXR family, LXRα (NR1H3 gene) and LXRβ (NR1H2 gene), are ligand-activated transcription factors that regulate gene expression whose state of activation can be effectively manipulated in vitro to study their contribution to distinct processes. Given these antecedents, LXR nuclear receptors constitute potential therapeutic targets in diseases with a high inflammatory component like arthritis or cancer.

184 p.-54 fig.-15 tab.

Contrato (FPU16/02756)

Peer reviewed