Los resultados de esta tesis han permitido identificar determinantes positivos del proceso de embriogénesis como la regulación hormonal por auxinas y citoquininas y la remodelación de la pared celular operada por la metilesterificación de pectinas y las AGPs. La auxina se induce y es necesaria para la reprogramación, el inicio y la progresión de la embriogénesis, mientras que la citoquinina es necesaria mayoritariamente en etapas avanzadas del desarrollo. Las pectinas desesterificadas y las AGPs también juegan un papel crucial en las fases avanzadas, regulando la remodelación de la pared celular, necesaria para la diferenciación del embrión. Asimismo, se han identificado determinantes negativos que reducen la eficiencia de la inducción embriogénica, como es el caso de la muerte celular inducida por el estrés inductor de embriogénesis en la cual intervienen la autofagia y proteasas PLCPs, las cuales también intervienen el proceso de muerte celular programada (MCP) del tapetum que tiene lugar durante el desarrollo in vivo de la microspora y el polen. Todos estos datos han permitido identificar nuevos determinantes del proceso de embriogénesis somática con un papel promotor o inhibidor de la inducción, inicio y/o progresión de la embriogénesis, los cuales actúan en distintos sistemas in vitro y diversas especies, sugiriendo mecanismos comunes que podrían estar actuando también en otras especies de interés, abriendo así la puerta a identificar nuevas dianas que permitan mejorar la eficiencia de la embriogénesis en especies de interés y su aplicación biotecnológica en programas de mejora agroforestal. Esta tesis ha dado lugar a 3 publicaciones en revistas científicas incluidas en el Journal Citation Report (JCR) y a 2 manuscritos actualmente en preparación. Estas publicaciones son las siguientes: 1. Pérez-Pérez Y, El-Tantawy A-A, Solís MT, Risueño MC, Testillano PS. (2019). Stress-induced microspore embryogenesis requires endogenous auxin synthesis and polar transport in barley. Frontiers in Plant Science, 10:1200. DOI:10.3389/fpls.2019.01200 2. Pérez-Pérez Y, Carneros E, Berenguer E, Solís M-T, Bárány I, Pintos B, Gómez-Garay A, Risueño MC, Testillano PS (2019). Pectin de-methylesterification and AGP increase promote cell wall remodeling and are required during somatic embryogenesis of Quercus suber. Frontiers in Plant Science, 9:1915. DOI: 10.3389/fpls.2018.01915 3. Pérez-Pérez Y, Bárány I, Berenguer E, Carneros E, Risueño MC, Testillano PS (2019). Modulation of autophagy and protease activities by small bioactive compounds to reduce cell death and improve stress-induced microspore embryogenesis initiation in rapeseed and barley. Plant Signaling & Behavior, 14:2, 1559577, DOI:10.1080/15592324.2018.1559577

The results obtained in this thesis led us to identify positive determinants of somatic embryogenesis such as hormonal regulation by auxins and cytokinins and cell wall remodeling controlled by methylesterification of pectins and arabinogalactan proteins (AGPs). Auxin is induced and necessary for cell reprograming, embryogenesis initiation and progression, whereas cytokinin is required mainly at advanced developmental stages. De-esterified pectins and AGPs also play a crucial role at late developmental stages in cell wall remodeling, a necessary process for embryo differentiation. Furthermore, negative factors that limit embryogenesis induction have been also identified, like cell death caused by the stress treatment required for embryogenesis induction in which autophagy and papain-like cysteine proteases (PLCPs) are involved, which are also implicated in the programmed cell death (PCD) process of the tapetum that takes place during in vivo development of the microspore and pollen. All these data allowed to identify new determinants of somatic embryogenesis process with a promoting or inhibiting role in cell reprograming and embryogenesis initiation and/or progression that participate in different in vitro systems and different species, suggesting common mechanisms that could also operate in other species of interest. These findings open new possibilities to identify new targets to improve embryogenesis efficiency in species of interest and its biotechnological application in agro-forestry breeding programs. The work performed in this thesis has given rise to three publications in scientific journals included in the Journal Citation Report (JCR) and two more manuscripts in preparation. These publications are the following: 1. Pérez-Pérez Y, El-Tantawy A-A, Solís MT, Risueño MC, Testillano PS. (2019). Stress-induced microspore embryogenesis requires endogenous auxin synthesis and polar transport in barley. Frontiers in Plant Science, 10:1200. DOI: 10.3389/fpls.2019.01200 2. Pérez-Pérez Y, Carneros E, Berenguer E, Solís M-T, Bárány I, Pintos B, Gómez-Garay A, Risueño MC, Testillano PS (2019). Pectin de-methylesterification and AGP increase promote cell wall remodeling and are required during somatic embryogenesis of Quercus suber. Frontiers in Plant Science, 9:1915. DOI: 10.3389/fpls.2018.01915 3. Pérez-Pérez Y, Bárány I, Berenguer E, Carneros E, Risueño MC, Testillano PS (2019). Modulation of autophagy and protease activities by small bioactive compounds to reduce cell death and improve stress-induced microspore embryogenesis initiation in rapeseed and barley. Plant Signaling & Behavior, 14:2, 1559577, DOI: 10.1080/15592324.2018.1559577

[ES]El proceso de embriogénesis somática in vitro es un ejemplo fascinante de totipotencia celular y una potente herramienta biotecnológica que permite la regeneración de plantas completas a partir de la reprogramación de distintas células somáticas. Cuando la célula reprogramada es la microspora (célula precursora del polen), el proceso se denomina embriogénesis de microsporas. In vivo, las microsporas siguen una ruta de desarrollo estrictamente regulada que conduce a la producción del grano de polen maduro. Sin embargo, mediante tratamientos de estrés, la microspora puede reprogramarse in vitro hacia una ruta embriogénica, produciendo embriones y plantas haploides y doble-haploides de gran utilidad en mejora vegetal. A pesar del enorme interés de la embriogénesis somática, aún se desconocen muchos de los mecanismos que regulan este proceso, lo cual resulta clave para poder mejorar su eficiencia en especies de interés agronómico y forestal. En esta tesis se han estudiado distintos efectores que actúan promoviendo o inhibiendo el proceso de embriogénesis somática, comparando su dinámica y posible implicación en tres especies modelo de interés agrario y forestal: la colza (Brassica napus), dicotiledónea oleaginosa; la cebada (Hordeum vulgare), monocotiledónea, cereal; y el alcornoque (Quercus suber), especie dicotiledónea, leñosa y forestal. El objetivo principal de esta tesis ha sido analizar nuevos elementos reguladores con la finalidad de conocer su papel en el inicio y la progresión de la embriogénesis somática, centrando el estudio en las hormonas auxina y citoquinina, la remodelación de la pared celular, la autofagia y las proteasas de la familia PLCP, empleándose para el estudio dos sistemas distintos de embriogénesis somática: por un lado la embriogénesis de microsporas inducida por estrés en dos especies cultivadas que requieren de distintos tratamientos de estrés térmico para la inducción de embriogénesis, calor (32ºC) en B. napus y frío (4ºC) en H. vulgare, y por otro la embriogénesis somática inducida a partir de embriones cigóticos inmaduros en la especie forestal Q. suber. Además, en determinados análisis también se ha llevado a cabo un estudio comparativo con la ruta de desarrollo in vivo del polen.

[EN]The in vitro somatic embryogenesis process is a fascinating example of cell totipotency and constitutes an important biotechnological tool for whole plant regeneration by reprogramming of different somatic cells. When microspore (pollen precursor cell) is the reprogrammed cell, the process is known as microspore embryogenesis. In vivo, the microspores follow a strictly regulated gametophytic developmental pathway to produce mature pollen grains. However, in response to stress treatments, the microspore can be reprogrammed in vitro towards an embryogenesis pathway, producing haploid and double-haploid embryos and plants, widely used in plant breeding. However, despite the great interest of somatic embryogenesis, the regulatory mechanisms that underlie this process are still unknown. Understanding the regulation of the process will permit to improve its efficiency in species of agronomic and forestry interest.In this PhD thesis different effectors that promote or inhibit the somatic embryogenesis process have been studied, comparing their dynamics and possible involvement in three model species of interest in agriculture and forestry: rapeseed (Brassica napus), an oleaginous dicot plant; barley (Hordeum vulgare), a monocot, cereal; and cork oak (Quercus suber), a dicot, woody forest specie. The main objective of this thesis was to analyse new regulatory elements in order to know their role in somatic embryogenesis initiation and progression, focusing the study on the hormones auxin and cytokinin, cell wall remodeling, autophagy and PLCP proteases, by using two different systems of somatic embryogenesis. On the one hand, microspore embryogenesis, induced by different stress treatment in two crop plant species, heat (32°C) in B. napus and cold (4°C) in H. vulgare; and on the other hand, somatic embryogenesis induced from immature zygotic embryos in the forest specie Q. suber. In addition, a comparative study has been carried out in some analyses with the gametophytic developmental pathway (in vivo) of the pollen grain.

Proyecto TRANSAUTOPHAGY, COST Action CA15138, financiado por la Comisión Europea. Proyectos AGL2014-52028-R y AGL2017-82447-R financiados por el Ministerio de Economía y Competividad ( MINECO )

Peer reviewed