En la siguiente etapa del proceso de selección se estudió el comportamiento enológico y la producción de compuestos aromáticos de las cepas en fermentaciones puras. Se detectaron diferencias significativas en los parámetros analizados entre las distintas especies de levaduras no-Saccharomyces estudiadas, mientras que en el caso de las cepas pertenecientes a la misma especie se encontraron diferencias en un menor número de parámetros. Sin embargo, entre ellos se encontraban algunos con gran impacto en la calidad del vino, como la acidez volátil. Los resultados también mostraron que ninguna de las cepas estudiadas fue capaz de completar la fermentación, lo que indicó que su empleo en vinificación requería la inoculación secuencial con S. cerevisiae. Además, se detectó que dos de las cepas de Lachancea thermotolerans crecían junto con Torulaspora delbrueckii, por lo que se decidió incluir esta combinación como inóculo mixto en los siguientes ensayos. El proceso de selección continuó con el estudio de la evolución de la composición aromática durante la fermentación alcohólica, así como el efecto en la composición de antocianos y estilbenos de los vinos elaborados con inoculaciones secuenciales no-Saccharomyces/S. cerevisiae. Los controles de implantación de las levaduras no-Saccharomyces inoculadas mostraron que las cepas de T. delbrueckii y L. thermotolerans y los inóculos mixtos constituidos por esas mismas especies permanecieron durante más tiempo en el medio, manteniendo la proporción inicial durante los primeros días de la fermentación. Al final de la misma, solo los vinos inoculados con T. delbrueckii y L. thermotolerans se diferenciaron de los demás por su perfil aromático. En cuanto a los análisis relacionados con el color, los resultados mostraron que los vinos fermentados secuencialmente con Metschnikowia pulcherrima, T. delbrueckii, Zygosaccharomyces bailii y Candida zeylanoides presentaban niveles más elevados de antocianos totales y valores más altos del índice de polifenoles totales respecto a los encontrados en los vinos elaborados solo con S. cerevisiae. En la última etapa del proceso de selección se evaluó el comportamiento enológico de las levaduras seleccionadas en vinos de tres variedades de uva: Tempranillo, Garnacha y Graciano. La mayor parte de las diferencias debidas a la estrategia de inoculación se detectaron en la variedad Tempranillo. Los cambios producidos en las características del vino podrían deberse a la mayor implantación y permanencia de los inóculos durante la fermentación en esta variedad. Las cepas de no-Saccharomyces empleadas en los inóculos habían sido originalmente aisladas en Tempranillo, lo que podría explicar su preadaptación a las características del mosto. A lo largo del proceso de selección, el inóculo formado por T. delbrueckii y L. thermotolerans había mostrado una mayor capacidad para implantarse en el medio durante la fermentación, permaneciendo durante un tiempo más prolongado en los depósitos. Por otro lado, la combinación de las características de las dos cepas que forman el inóculo permitió la liberación de compuestos de interés para la calidad del vino como lactato de etilo, glicerol o ácido láctico. Asimismo, los vinos elaborados con esta combinación de levaduras mostraron mayores contenidos de vitisina B, relevante para la estabilidad del color. Este inóculo presentaba además actividades enzimáticas interesantes para mejorar el color y el aroma del vino. Considerando sus características positivas para la calidad de los vinos, y dado que no existe en el mercado un inóculo compuesto por estas especies de levaduras no-Saccharomyces, el inóculo mixto de T. delbrueckii y L. thermotolerans podría tener potencial para ser comercializado, por lo que es el que finalmente ha sido seleccionado en este estudio.

La fermentación alcohólica espontánea del vino es un proceso microbiano resultante de la acción secuencial de diferentes levaduras no-Saccharomyces y Saccharomyces. El uso de cultivos seleccionados de Saccharomyces cerevisiae en las fermentaciones es una práctica extendida en la industria enológica que ha contribuido a un mejor control de la vinificación, pero también a una simplificación de las comunidades microbianas que participan en las fermentaciones, dando lugar a una pérdida de complejidad y cierta estandarización de los vinos. Para evitar la homogeneidad de los vinos inoculados con cepas comerciales de S. cerevisiae, se ha propuesto el empleo de levaduras no-Saccharomyces seleccionadas en fermentaciones secuenciales con S. cerevisiae. Esta práctica permite obtener algunas de las ventajas de las fermentaciones espontáneas como una mayor complejidad organoléptica, pero con un mayor control del proceso. El objetivo de este trabajo fue seleccionar cepas de levaduras no-Saccharomyces para su empleo como inóculos en la elaboración de vinos tintos de calidad. El estudio comenzó con 103 aislados procedentes de diferentes ecosistemas enológicos de la Denominación de Origen Calificada Rioja. En una etapa inicial se llevó a cabo la caracterización clonal y el estudio de la resistencia al SO2 de las cepas, así como la actividad killer y las posibles interacciones con otras levaduras presentes en las vinificaciones, como S. cerevisiae y Brettanomyces bruxellensis. El siguiente paso fue la caracterización de las cepas en base a su capacidad para producir enzimas de interés enológico. Se evaluaron 13 actividades enzimáticas relacionadas con el aroma, el color y la clarificación de los vinos. Los resultados mostraron una gran variabilidad intraespecífica, lo que puso de manifiesto la importancia de la selección a nivel clonal.

Tesis doctoral presentada para lograr el título de Doctor por la Universidad de La Rioja, Facultad de Ciencia y Tecnología, Departamento de Agricultura y Alimentación.--2021-11-30