Among a set of lacase (commercial or developed in the lab), laccase 7D5 was selected as biocatalyst for the synthesis of polyaniline due to its superior activity towards aromatic amines and stability at acid pH. Different enzyme doses, different concentrations and types of anionic surfactants, and different reaction conditions were assayed. After a deeply characterization of the resulting polymers, the optimal conditions for the synthesis of emeraldine salt (the electroconductive form of PANI) with SDBS as anionic surfactant were set. The resulting polianiline is water-soluble, displays a nanofibered supramolecular structure (yielding high contact surface) and shows excellent electroactivity and electroconductivity, all of it at a high production yield. 3.2. Structure-function comparison of 7D5 laccase and the wild-type laccase Laccase 7D5 was over-expressed in an A. oryzae industrial strain. This allowed to obtain the crystal structure of the enzyme (PDB: 6H5Y) and carry out a structure-function comparison study with the wild laccase from basidiomycete PM1 (PDB: 5ANH), the parental laccase of 7D5 with which it shares the highest sequence identity. The engineered laccase showed a significantly improved catalytic activity towards all the substrate assayed. By PELE and QM/MM simulations it was identified a mutation in the catalytic pocket of 7D5 that improved the substrate positioning and the electron transfer in the catalytic pocket. Even though both enzymes showed high thermal and pH stabilities, the lower stability of 7D5 laccase was related, by computational studies, with the loss of flexibility of certain superficial loops due to the acquired mutations. 3.3. Engineering of 7D5 laccase Through directed evolution of 7D5 CDS fussed to the α–factor pre-proleader sequence, two new mutations in the signal sequence that improved the enzyme expression in S. cerevisiae more than five times were discovered. Subsequently, by PELE and QM/MM simulations, two mutations in the catalytic pocket of the enzyme that increased the catalytic constant towards anilines due to a better substrate-laccase interaction were identified. This new variant was subjected to saturation mutagenesis in a residue close to the catalytic copper whose mutation in this and previous studies was associated with significant activity improvements but with concomitant loss of stability. A mutation in this position that improved significantly the enzyme expression without significant loss in stability was selected by combining experimental assays and computational simulations. The substitution of the C-terminal tail of this last variant by other from a more stable laccase lead to the final variant (RY2), with four new mutations. RY2 displayed improved catalytic constants towards all the substrates assayed due to a higher flexibility of the C-terminal, which now interacts with the O2/H2O channel.

De la comparación de diferentes lacasas (comerciales y obtenidas en el laboratorio), se seleccionó la lacasa 7D5 para su empleo como biocatalizador en la síntesis de polianilina debido a su mayor actividad sobre aminas aromáticas y mayor estabilidad a pH ácido. Se ensayaron diferentes concentraciones de enzima, diferentes concentraciones y tipos de surfactantes aniónicos y distintas condiciones de reacción. Tras una exhaustiva caracterización de los polímeros resultantes, se determinaron las condiciones óptimas de síntesis de sal de esmeraldina (forma electroconductiva de PANI) con SDBS como surfactante aniónico. La polianilina resultante es soluble en agua, presenta una estructura supramolecular en forma de nanofibras (ofreciendo una gran superficie de contacto), una excelente electroactividad y electroconductividad, y se obtiene con un notable rendimiento. 3.2. Comparación estructura-función de la lacasa 7D5 y la enzima salvaje La lacasa 7D5 fue híper-expresada en una cepa industrial de A. oryzae. Esto permitió obtener su estructura cristalina (PDB: 6H5Y) y realizar un estudio estructura-función comparado con la lacasa salvaje del basidiomiceto PM1 (PDB: 5ANH), con la que 7D5 comparte un 98 % de identidad de secuencia. La lacasa obtenida en el laboratorio mostró una mejora significativa en la actividad catalítica frente a todos los sustratos ensayados con respecto a la lacasa salvaje. Mediante simulaciones computacionales de PELE y QM/MM se determinó que una mutación en el bolsillo catalítico de 7D5 mejoraba el posicionamiento y transferencia electrónica de los sustratos al cobre catalítico. Aunque ambas enzimas mostraron buena estabilidad a temperatura y pH, la menor estabilidad de la lacasa 7D5 se relacionó en estudios computacionales con la pérdida de flexibilidad en algunos lazos superficiales de la proteína provocada por las mutaciones adquiridas. 3.3. Ingeniería de la lacasa 7D5 Mediante evolución dirigida de la secuencia codificante de la enzima 7D5 unida a la secuencia evolucionada del pre-prolíder del factor α, se obtuvieron dos nuevas mutaciones en la secuencia señal que incrementaron más de cinco veces la expresión de la enzima en S. cerevisiae. Posteriormente, por simulaciones de PELE y QM/MM, se identificaron dos mutaciones en el bolsillo catalítico de la enzima que incrementaron significativamente la constante catalítica para la oxidación deanilinas debido una mejor interacción lacasa-sustrato. Esta nueva variante se sometió a mutagénesis saturada en un residuo próximo al cobre catalítico cuya mutación al azar en este estudio y en estudios previos se asociaba con mejoras significativas en la actividad catalítica pero con pérdida de estabilidad. Combinando ensayos experimentales y computacionales se seleccionó una mutación en esta posición que incrementaba

[ES]Las lacasas (EC 1.10.3.2) son oxidasas multicobre capaces de oxidar una gran variedad de compuestos aromáticos y ciertos metales. Su versatilidad de sustrato y sus bajos requerimientos catalíticos hacen de estas enzimas biocatalizadores de interés para distintos sectores. Una de las aplicaciones más interesantes de las lacasas es la síntesis de compuestos orgánicos de alto valor añadido, ofreciendo una mayor selectividad que las reacciones químicas y con menor generación de residuos tóxicos. Para muchas de estas reacciones, se requiere el empleo de lacasas fúngicas de alto potencial redox debido a su mayor poder oxidativo. Tal es el caso de la polimerización de anilina para obtener polianilina (PANI), un polímero electroconductor con una amplia variedad de aplicaciones. Sin embargo, las condiciones de reacción (pH ácido y presencia de surfactantes) y el alto potencial redox de la anilina a pH ácido dificultan la acción de la enzima, haciendo necesaria su ingeniería para optimizar su actividad y estabilidad en dichas condiciones. En estudios previos, dos lacasas fúngicas de alto potencial redox fueron evolucionadas en el laboratorio para su expresión en Saccharomyces cerevisiae. Posteriormente, se recombinaron dichas enzimas para obtener una librería de lacasas quiméricas con diferentes actividades y estabilidades. De entre ellas, se seleccionó la lacasa 7D5 como punto de partida de esta Tesis Doctoral. El principal objetivo de esta Tesis Doctoral fue obtener una lacasa fúngica de alto potencial redox que actuase como biocatalizador para reacciones de síntesis orgánica, con especial interés en la síntesis de polianilina electroconductiva. Para ello se llevaron a cabo diferentes tareas: 1. Optimización de las condiciones de reacción para la síntesis de polianilina conductiva, incluyendo la selección de la lacasa y del compuesto que actuará como molde dopante para obtener la máxima producción de polianilina con las mejores características. 2. Diseño de la enzima por evolución dirigida y diseño computacional para mejorar la actividad lacasa hacia aminas aromáticas sin reducir su versatilidad de oxidación sobre otros sustratos y, simultáneamente, aumentar la estabilidad de la enzima en las condiciones de reacción de síntesis de polianilina. 3. Mejora de la secreción de la enzima por S. cerevisiae y expresión de las nuevas variantes de lacasa en una cepa industrial de Aspergillus oryzae 4. Caracterización bioquímica, cinética, computacional y estructural de las nuevas variantes de lacasa para mejorar el conocimiento estructura-función de estas oxidasas multicobre. 3.1. Síntesis de polianilina catalizada por lacasa

[EN]Laccases (EC 1.10.3.2) are multicopper oxidases with the capability to oxidize a great variety of aromatic compounds and some metals. Their substrate versatility and their low catalytic requirements turn these enzymes into biocatalysts of interest for different sectors. One of the most promising applications of laccases is the synthesis of high value organic compounds, providing higher selectivity than chemical reactions and generating less toxic residues. For many of these reactions fungal high redox potential laccases are required due to their higher oxidation capabilities. One of these reactions is the synthesis of polyaniline (PANI), an electroconductive polymer with a large number of applications. However, the reaction conditions (acid pH and surfactants presence) and the high redox potential of aniline at acid pH hinder laccase activity, requiring the engineering of the enzyme to optimize their activity and stability under these conditions. In previous works, two high redox potential fungal laccases were evolved in the laboratory for their expression in Saccharomyces cerevisiae. These enzymes were thereafter recombined to obtain a library of chimeric laccases with different activities and stabilities. Among them, 7D5 laccase was selected as starting point for this Doctoral Thesis. The main objective of this Doctoral Thesis was to develop a high redox potential laccase as biocatalyst of industrial interest for organic synthesis, with a special emphasis in the synthesis of electroconductive polyaniline. For this, different tasks were considered: 1. Optimization of the reaction conditions for the enzymatic synthesis of conductive polyaniline, including selection of laccase and doping template, to obtain a polymer with best performing properties at high production yields. 2. Enzyme directed evolution and computational design to enhance laccase activity towards aromatic amines without reducing its substrate versatility and, simultaneously, improve the stability of the enzyme to the reaction conditions of polyaniline synthesis. 3. Improvement of laccase secretion by S. cerevisiae and assessment of the over-expression of the new laccase variants in an Aspergillus oryzae industrial strain. 4. Biochemical, kinetical, computational and structural characterization of the laccase variants obtained to contribute to improve the structure-function knowledge of these multicopper oxidases. 3.1. Synthesis of polyaniline catalyzed by laccase

significativamente la expresión de la enzima sin pérdidas importantes de estabilidad. La sustitución del extremo C-terminal de esta última variante por el de otra lacasa termoestable, dio lugar a la variante final RY2 con cuatro nuevas mutaciones. RY2 presentó una mejora en las constantes catalíticas frente a todos los sustratos probados. La mayor flexibilidad de su C-terminal, que ahora interacciona con el canal de entrada de O2/H2O, podría explicar estas mejoras, así como el incremento en la estabilidad de la enzima, gracias a una mayor capacidad de absorber el impacto de las altas temperaturas protegiendo el resto de la estructura proteica. Varias de las variantes obtenidas durante la ingeniería de 7D5 fueron exitosamente expresadas en A. oryzae. Esto facilitó su empleo para catalizar la síntesis de polianilina a mayor escala, así como de un nuevo colorante orgánico cuyas excelentes propiedades como tintes textiles fueron demostradas en un entorno industrial. 4.Una vez demostrada la viabilidad de la síntesis enzimática de polianilina conductiva con excelentes propiedades, la ingeniería de la enzima permitió incrementar los rendimientos de obtención del polímero. Además, la variante final de lacasa obtenida mediante diferentes técnicas de ingeniería de proteínas es estable a alta temperatura y diferentes pH, y presenta una elevada actividad catalítica frente a diversos sustratos como fenoles, aminas aromáticas o mediadores redox. Al mismo tiempo esta nueva lacasa se expresa en S. cerevisiae en niveles superiores a los descritos hasta la fecha. La lacasa de partida (7D5) y algunas de sus variantes obtenidas durante su evolución en el laboratorio fueron expresadas en A. oryzae a escala de relevancia industrial. Esto ha permitido obtener la primera estructura cristalina de una lacasa de basidiomiceto diseñada en el laboratorio y llevar a cabo un exhaustivo estudio estructura función, comparándolo con la lacasa salvaje PM1. Por otro lado, una de las variantes evolucionadas en S. cerevisiae e hiper-expresadas en A. oryzae se aplicó con éxito como biocatalizador de la síntesis de PANI y de otro compuesto orgánico cuya caracterización como colorantes textiles se llevó a cabo en un entorno industrial.

This higher flexibility of the C-terminal enables the terminal tail to absorb the impact of high temperatures protecting the protein structure, thus increasing the stability of the enzyme. Some of the laccase variants obtained during the engineering of 7D5 were successfully over-expressed in A. oryzae. This make easier its use for the catalysis of the synthesis of polyaniline and of a new organic dye whose excellent properties as textile dyes were tested in an industrial environment. 4. Conclusions Once proven the enzymatic synthesis of conductive polyaniline with excellent properties, the engineering of the enzyme allowed improving the polymer’s production yields. Furthermore, the final laccase variant obtained by means of different protein engineering techniques is stable to high temperature and extreme pH, and it shows high catalytic activity towards different substrates as phenols, aromatic amines or redox mediators. Simultaneously, this new laccase is secreted by S. cerevisiae at higher levels than those reported in the literature. The parental laccase (7D5), and some of the variants obtained during its design in the laboratory, were expressed in A. oryzae at relevant industrial scale. This allowed to obtain the first crystal structure of a basidiomycete laccase engineered in the laboratory and to perform a deep structure-function comparison study with the wild-type laccase from PM1. Furthermore, one of the S. cerevisiae evolved variant over-expressed in A. oryzae was successfully applied as biocatalyst in the synthesis of PANI and other organic compound which characterization as textile dyes was carried out in an industrial environment.

Proyectos europeos (INDOX, KBBE 2013-7-613549) y (BBI JU WoodZymes, H2020-BBI-JU-792070) y proyectos nacionales NOESIS (BIO2014-56388-R) y GENOBIOREF (BIO2017-86559-R).

199 p.-41 fig.-7 tab.

Peer reviewed