Las diamino oxidasas (DAO) son enzimas capaces de catalizar la desaminación oxidativa de aminas biógenas (AB) con la consiguiente formación de aldehídos inocuos. Estas AB aparecen como resultado de la descarboxilación de aminoácidos precursores debido a la actividad enzimática de algunas cepas de bacterias lácticas, y se producen con frecuencia en alimentos y bebidas fermentadas, como el vino. Llevan asociado un relevante problema de seguridad alimentaria ya que en altas concentraciones y en personas sensibles, pueden causar problemas de salud como dolores de cabeza, dificultad respiratoria, palpitaciones del corazón, hipertensión, etc. Además, pueden alterar las propiedades organolépticas de los alimentos. El objetivo principal de este estudio es la eliminación de AB mediante el uso de derivados inmovilizados y estabilizados de AO y su consecuente uso biotecnológico a escala industrial. La hipótesis de trabajo es la inmovilización de DAO por unión covalente multipuntual a soportes altamente activados con grupos aldehído, como son los soportes glioxil-agarosa. Mediante el uso de estos soportes podemos dirigir la inmovilización por el área más rica en residuos reactivos de la superficie de la proteína (área más rica en lisinas) (Gx_DAO (I)) o por el extremo amino terminal en el caso de enzimas multiméricas (Gx_DAO (II)). De esta forma la orientación de la enzima es diferente y por tanto también lo será su rigidificación y estabilidad. Además, con el catalizador con mejores resultados hemos abordado una estrategia de postinmovilización recubriendo covalentemente el catalizador con un polímero hidrofílico, dextrano-aldehído (DxAl) de diferente tamaño (6000, 15000 y 40000 Da), que nos permite proteger la enzima y aumentar aún más su estabilidad. La optimización de diferentes parámetros, como el uso de polietilenglicol (PEG) durante el proceso de inmovilización, o la cantidad y tamaño del polímero empleado en el proceso de postinmovilización nos permitió llevar a cabo la preparación de un derivado activo y muy estable de DAO (Gx_DAO (II) recubierto con DxAl 6000). Los resultados obtenidos en el presente trabajo muestran que con ambos derivados (Gx_AO (I) y Gx_AO (II)) conseguimos un 99,8% de inmovilización usando 30% PEG durante el proceso de inmovilización. Además se muestra que el polímero que aporta mayor estabilidad al derivado es el de 6000Da. También observamos que el derivado Gx_AO (II) tiene un factor de estabilización 8 veces mayor que el derivado Gx_AO (I), y 53 veces mayor que el derivado unipuntual que es completamente inactivado después de tan solo 20 horas bajo las mismas condiciones. Tras recubrirlo con dextrano-aldehído de 6000Da (Gx_AO (II)_DxAl6000) el factor de estabilización del derivado es de 20 veces más con respecto al derivado sin modificar (Gx_AO (II)). La estabilización global es del orden de 1000 veces. Por tanto, mediante este protocolo de inmovilización se aumenta la estabilidad en condiciones inactivantes, como son las condiciones de incubación en el vino (presencia de etanol y pH4.0) y la posibilidad de reutilización de los biocatalizadores inmovilizados para su aplicación a nivel industrial.

Los autores agradecen la financiación otorgada por la Fundación Ramón Areces en el XVII Concurso Nacional de Ayudas a la Investigación en Ciencias de la Vida y la Materia del año 2014.

Resumen del trabajo presentado al Congreso Nacional de Biotecnología, celebrado en Murcia del 18 al 21 de junio de 2017.

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