En esta Tesis Doctoral se han caracterizado las dos proteínas nucleares de Allium cepa mediante inmunodetección e inmunoprecipitación con dos sueros anti-MFP1 desarrollados contra las proteínas de tomate y Arabidopsis. AcMFP1-78 KDa tiene un valor de pI experimental ligeramente ácido (5,5) y es inmunoprecipitada e inmunodetectada por ambos sueros. Es una proteína constitutiva, que se distribuye en distintos subdominios nucleares en función del tipo celular y el tejido, como se ha demostrado mediante inmunofluorescencia con los mismos sueros. El análisis de microscopía electrónica ha demostrado que se distribuye por pequeños dominios localizados preferentemente en la periferia de las masas de heterocromatina densa. AcMFP1-78 KDa posee una doble localización subcelular, en el núcleo y en los cloroplastos, con un patrón de distribución similar al de MFP1 en otras especies. Allium cepa posee una segunda proteína homóloga de 90 KDa y pI básico (8,5-9,5) con distintos estados de fosforilación de los que depende su unión a la matriz nuclear. Se ha demostrado que la Caseína Kinasa CK2 endógena está implicada en la regulación de dicha unión. AcMFP1-90 KDa se acumula en cuerpos nucleares cuya presencia en el núcleo está favorecida por la proliferación celular y la presencia de luz. También se distribuye por el retículo de la matriz nuclear, habiéndose detectado asociada a los filamentos del nucleoesqueleto. Se ha comprobado mediante estudios de co-localización que las proteínas AcMFP1 no forman parte de los complejos de replicación del ADN ni de los de procesamiento co-transcripcional del ARN, ni tampoco parecen estar relacionadas con los procesos de maduración y almacenamiento de los factores de splicing en los gránulos intercromatínicos o los cuerpos de Cajal. Las distintas características y patrones de distribución y expresión de ambas proteínas AcMFP1 sugieren funciones diferentes, o al menos formas distintas de regulación. El conjunto de los resultados sugiere una interacción de AcMFP1-78 KDa con la cromatina descondensada, así como una función estructural para AcMFP1-90 KDa en la matriz nuclear.

MFP1 (MAR-binding Filament-like Protein 1) es una proteína con capacidad para unir regiones MARs (Matrix Attachment Regions) de ADN, y contiene un extenso dominio coiled-coil. Se conoce su secuencia completa en tomate, Arabidopsis y tabaco. Su secuencia está dividida en dos dominios principales, el más corto corresponde al extremo N-terminal de la proteína y contiene dos regiones hidrofóbicas y una señal de transición a cloroplastos. El resto de la secuencia la ocupa un largo dominio coiled-coil, donde se localizan una señal de localización nuclear y un subdominio de unión a ADN, con dos sitios de fosforilación para Caseína Kinasa CK2 con la capacidad de inhibir dicha unión. Sueros específicos contra distintos dominios de MFP1 detectan esta proteína de 80 KDa en distintos tejidos y especies vegetales, indicando su conservación en plantas. Mediante técnicas de fraccionamiento celular y análisis de MFP1-GFP en células transfectadas, se ha detectado la proteína en los plastidios, y con cierta controversia en el núcleo y la matriz nuclear, que es la estructura nuclear no-cromatínica implicada en la organización del genoma y los distintos subdominios del núcleo. Se desconoce la función de MFP1, aunque basándose en sus potenciales características estructurales y su capacidad para unir ADN, se ha propuesto que podría ejercer un papel en la organización de los genomas del cloroplasto y el núcleo. Estudios anteriores mediante un suero anti-LeMFP1 nos permitieron identificar dos proteínas nucleares antigénicamente relacionadas en Allium cepa de 80 y 90 KDa. La primera es una proteína nuclear soluble, mientras que la segunda forma parte de la matriz nuclear y se distribuye por los filamentos del nucleoesqueleto y en una nueva categoría de cuerpos nucleares.

Beca de FPI asociada al proyecto DGICYT P98-0647 del Ministerio de Ciencia y Tecnología

184 p.-50 fig.-20 tab.-2 apéndices.

Peer reviewed