[ES] 1. Introducción: La Demencia Lobar Frontotemporal (DLFT) describe un espectro de enfermedades neurodegenerativas, clínica, patológica y genéticamente heterogéneas con una característica común, la degeneración relativamente selectiva de lóbulos frontales y temporales. La DLFT también se caracteriza por cambios progresivos en el comportamiento, la personalidad y/o el deterioro del lenguaje, con preservación inicial de la memoria y puede diferenciarse clínicamente en tres grupos clínicos principales: la Demencia Frontotemporal variante conductual (DFT-vc), la Demencia Semántica (DS) y la Afaxia primaria progresiva no fluente (APPNF), entre otros. Los recientes avances en la biología molecular y en técnicas inmunohistoquímicas han permitido la clasificación de la DLFT basándose en la naturaleza de las proteínas de inclusión predominantes en el cerebro de pacientes, en tres categorías principales: con inclusiones de la proteína tau asociada a microtúbulos (DLFT-tau), con inclusiones de la proteína FUS (DLFT-FUS) y con agregados de la proteína TARDNA-Binding Protein 43 (TDP-43) (DLFT-TDP), entre otros. Las mutaciones en los genes MAPT, GRN, TARDBP, VCP, CHMP2B y C9ORF72 se han asociado con la DLFT. Particularmente, las mutaciones en GRN que codifican la proteína Progranulina (PGRN) han sido identificadas como una causa principal de DLFT-TDP, conduciendo a inclusiones de la proteína TDP-43, por un mecanismo de haploinsuficiencia. PGRN juega un papel importante en las funciones celulares, incluyendo la malignidad, la inflamación y la migración celular y también se ha relacionado con la viabilidad y el mantenimiento de la supervivencia en las neuronas. Si bien, los mecanismos por los que la aploinsuficiencia en PGRN conducen a la neurodegeneración siguen siendo especulativos, cada vez más pruebas apoyan la hipótesis de que la reentrada de las neuronas postmitóticas en el ciclo celular precede en muchos casos a una muerte neuronal. Se ha visto que la PGRN puede regular las vías de señalización celular importantes para la supervivencia neuronal. Por otra parte, la disfunción mitocondrial puede ser un factor importante en la muerte neuronal. Alteraciones en las principales funciones mitocondriales, tales como el tamponamiento del Ca 2+, la producción de energía, la generación de ROS y el control de la vía intrínseca de apoptosis, pueden contribuir a la pérdida neuronal. El objetivo fundamental de este trabajo fue elucidar el papel patogénico de la deficiencia de PGRN en la DLFT-TDP, estudiando qué papel que juega en la regulación de los mecanismos de supervivencia/muerte celular, usando como modelo experimental células de neuroblastoma SH-SY5Y en las que se silenció el gen GRN. 2. Objetivos: Caracterizar la línea celular de neuroblastoma SH-SY5Y GRN KD como modelo de estudio celular para la DLFT-TDP asociada con la deficiencia de PGRN. - Analizar la relación entre la disfunción mitocondrial y la deficiencia de PGRN en nuestras células SH-SY5Y GRN KD. - Estudiar la perturbación de los mecanismos moleculares implicados en el control del ciclo celular y en la apoptosis, inducida por la deficiencia de PGRN.

2. Aims -To characterize the neuroblastoma cell line SH-SY5Y GRN KD as a model cell study for the FTLD-TDP associated with PGRN deficiency.- To elucidate the relationship between mitochondrial dysfunction and PGRN deficiency in GRN KD cells.-To study the molecular mechanisms involved in the perturbation of cell cycle and apoptosis regulation, induced by PGRN deficiency.3. Results: We found that neuroblastoma GRN KD cells recapitulate essential FTLD features in addition to reduced PGRN levels, such as increased TDP-43 phosphorylation, cell signalling alterations, and reduced viability. An inverse relationship was observed between the rate of BrdU incorporation and cell viability. Moreover, PGRN deficiency results in reduced basal and stimulated respiration leading to reduced mitochondrial membrane potential ( Compared with control cells, survival of GRN KD SH-SY5Y cells was severely reduced in serum-free medium. Cell death showed features of apoptosis such as increased activation of executive caspases and cytochrome c released from the mitochondria. Our results suggest that alterations in the CDK4/6/pRb pathway secondary to changes in the activity of the PI3K/Akt and ERK1/2 pathways induced by PGRN deficiency are involved in the control of serum deprivation-induced apoptosis. Addition of exogenous PGRN or conditioned medium from control cells to GRN KD cells rescue the normal cell responses to serum addition or withdrawals. In summary, our data indicate a neuroprotective role for PGRN and provide further support for the premise that chronic PGRN deficiency in FTLD results in the perturbation of important signaling pathways and increase rates of neuronal cell death. It is suggested that increasing PGRN levels or alternatively modulating the Wnt cascades or the PI3k/Akt and ERK1/2 pathways may be useful for designing new therapeutic treatment for FTLD-TDP. 4. Conclusión: - GRN KD cells recapitulate the most important pathological features of FTLD-TDP, such as PGRN deficiency, TDP-43 hyperphosphorylation and increased neuronal vulnerability. This cellular model can be considered a good experimental model for the study of FTLD. - GRN KD cells exhibit significant alterations in mitochondrial function related to neurodegeneration, such as mitochondrial membrane depolarization, decrease in respiration rate and energy production, as well as a significant increase in the generation of ROS. - PGRN plays a neuroprotective role in SH-SY5Y cells, as the PGRN deficiency causes changes in the regulation of the cell cycle. Our results suggest that the activation of Wnt signaling pathway in the pathogenesis of FTLD-TDP culminates in cell cycle activation and apoptosis. - PGRN deficiency induces significant alterations in the stimulation of the PI3K/Akt-ERK1/2/CDK4/6/pRb pathway that determines the cell fate, survival/death, under serum deprivation. - The results of this thesis provide some clues about FTLD-TDP pathogenesis. The identification of potential therapeutic targets allows to consider GRNKD cell a suitable platform for the preclinical evaluation of novel treatments for this disease

3. Resultados: Observamos que las células GRN KD recapitulan las características patológicas más importantes de DLFT-TDP como la deficiencia de PGRN, la hiperfosforilación TDP- 43, la viabilidad reducida, y alteraciones en algunas cascadas de señalización intracelular. Demostramos la existencia de una relación inversa en la incorporación de BrdU y la viabilidad celular. Las células GRN KD mostraron cambios en la función mitocondrial, tales como una disminución en la respiración basal y estimulada que conduce a una reducción del potencial de membrana ( cambios se acompañaban de un aumento de la masa mitocondrial, lo que podría constituir un mecanismo para intentar compensar la menor producción de energía. Nuestros resultados mostraron una sobreactivación tanto de la vía canónica como no canónica de Wnt en las células GRN KD. Detectamos un aumento en los niveles de expresión de los ligandos de los receptores Frizzled, Wnt1 y Wnt5a, así como evidencias de la estimulación de las cascadas Wnt/β-catenina y Wnt/Ca 2+ en las células GRN KD, que resultaba en un aumento de la síntesis de ADN, asociada con mayor muerte celular. En comparación con las células control, las células GRN KD presentaron una mayor susceptibilidad a la muerte inducida por la privación del suero. La retirada del suero produce la estimulación de la apoptosis como indica la liberación del citocromo c desde la mitocondria, y/o la activación de las caspasas ejecutoras. Nuestros resultados sugieren que las alteraciones de la vía de señalización CDK4/6/pRb, secundarias a cambios en la activación de PI3K/Akt y ERK1/2 inducidos por deficiencia de PGRN, están implicadas en el control de la apoptosis inducida por la privación del suero. La adición de PGRN recombinante o medio condicionado por las células control a las células GRN KD, fue capaz de rescatar la respuesta celular normal a la presencia o ausencia de suero. En resumen, nuestros resultados demuestran el papel neuroprotector de PGRN y apoya la idea de que la deficiencia crónica de PGRN resulta en la perturbación de mecanismos de señalización, que en último término producen la muerte neuronal. Se sugiere que el aumento de los niveles de expresión de PGRN, o alternativamente la modulación de la actividad de las vías de señalización Wnt, PI3K/Akt y ERK1/2, podría tener interés para el diseño de nuevas estrategias terapéuticas para el tratamiento de la DLFT. 4. Conclusiones: - Las células GRN KD recapitulan las características patológicas más importantes del DLFT-TDP, tales como la deficiencia de PGRN, la hiperfosforilación TDP-43 y el aumento de la vulnerabilidad neuronal. Este modelo celular puede ser considerado un buen modelo experimental para el estudio de DLFT. - Las células SH-SY5Y deficientes en PGRN presentan alteraciones significativas en la función mitocondrial, relacionadas con la neurodegeneración como la despolarización de la membrana mitocondrial, la disminución de la tasa de respiración y la producción de energía, así como un aumento significativo en la generación de ROS.

[EN] 1. Introduction: Frontotemporal Lobar Degeneration (FTLD) describes a spectrum of clinically, pathologically and genetically heterogeneous disease with a common feature, the relatively selective degeneration of frontal and temporal lobes. FTLD is a leading cause of early-onset dementia. FTLD is also characterized by progressive changes in behavior, personality and/or language impairment with early preservation of memory. The main clinical presentations of FTLD are: behavioral variant of frontotemporal dementia (bv-FTD), primary progressive aphasia (PPA), and semantic dementia [SD]. Recent advances in molecular biology and immunohistochemical staining techniques have further classified the FTLD disorders based upon the predominant inclusion protein into three main categories: microtubule-associated protein tau (FTLD-tau), fused in sarcoma protein (FTLD-FUS) and TAR DNA-binding protein-43 (FTLD-TDP). Mutations in genes MAPT, GRN, TARDBP, VCP, CHMP2B and C9ORF72 have been associated with FTLD. Particularly mutations in GRN encoding progranulin protein (PGRN) have been identified as a major cause of autosomal dominant FTLD-TDP, leading to TAR DNA binding protein 43 (TDP-43) inclusions by a haploinsufficiency mechanism. PGRN plays important roles in cellular functions including malignancy, inflammation and cell migration and also has been related to viability and survival maintenance in neurons. While the mechanisms by which PGRN haploinsufficiency leads to neurodegeneration remained speculative, increasing evidence support the hypothesis that cell cycle reentry of postmitotic neurons precedes many instances of neuronal death. It has been reported that PGRN can regulate cellular signaling pathways involved in neuronal survival. On the other hand, mitochondrial dysfunction may be an important factor in neuronal death. Alterations in the major mitochondrial functions, such as Ca2+ buffering, energy production, generation of ROS, and control of the intrinsic pathway of apoptosis may contribute to neuronal loss. This work was undertaken to further study the pathogenic role of PGRN deficiency in FTLD-TDP, by studying how the regulation of survival/death mechanisms is perturbed, using as experimental model GRN knockdown neuroblastoma SH-SY5Y cells (GRN KD)

- La PGRN juega un papel neuroprotector en las células SH-SY5Y, ya que su déficit provoca cambios en la regulación del ciclo celular. Nuestros resultados sugieren que la activación de las vías de señalización de Wnt en la patogénesis de la DLFT-TDP culmina en la activación del ciclo celular y la apoptosis. - La deficiencia de PGRN induce alteraciones significativas en la estimulación de la vía de señalización PI3K/AktERK1/2/CDK4/6/pRb que determina el destino celular, supervivencia/muerte, en ausencia de suero. - Los resultados de esta tesis aportan algunas claves para el esclarecimiento de la patogénesis de la DLFT-TDP. La identificación de posibles dianas terapéuticas permite considerar a las células GRN KD una plataforma útil para la evaluación preclínica de nuevos tratamientos para esta enfermedad.

Recursos aportados por el Ministerio de Economía y Competitividad (SAF2011-28630)(2012-2014) y por la Fundación Ramón Areces (2012-2015)

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Peer reviewed