En esta tesis se han abordado estudios estructura-función de un nuevo tipo de peroxidasa producida por el hongo ligninolítico Pleurotus eryngii, denominada peroxidasa versátil (VP). Esta hemoproteína se caracteriza por su amplia especificidad de sustrato, que incluye desde un ion metálico como el 2+Mn hasta compuestos aromáticos fenólicos y no fenólicos o colorantes de tipo azo. Para estos estudios se ha desarrollado un sistema de expresión heteróloga de la VP en Escherichia coli, situando el cDNA correspondiente a la proteína madura bajo el control del promotor tac en el vector de expresión pFLAG1. La proteína expresada se acumuló en forma de cuerpos de inclusión, que se aislaron y solubilizaron en presencia de urea, para realizar posteriormente el plegamiento in vitro de la peroxidasa recombinante. Se investigó la influencia de diferentes parámetros en la reacción de plegamiento, incluyendo el pH, las condiciones redox y la concentración de proteína, urea e iones calcio. El protocolo optimizado permite recuperar hasta un 10% de enzima en forma activa, un rendimiento tres veces superior al obtenido para otras peroxidasas estructuralmente similares. Utilizando la enzima recombinante se han realizado estudios mediante la técnica de stopped-flow para la caracterización espectroscópica del ciclo catalítico y el análisis de la cinética del estado transitorio de la reacción de la VP con el H2O2 y el alcohol veratrílico (VA), que es uno de sus sustratos reductores. Los resultados obtenidos ponen de manifiesto unas propiedades de los intermediarios de oxidación formados durante el ciclo de la VP (compuestos I y II) muy similares a las de otras peroxidasas estudiadas. Se ha calculado la constante de formación del compuesto I a distintos valores de pH, así como las constantes de formación y reducción del compuesto II por el VA. Los estudios de NMR de la proteína en disolución y difracción de rayos X tras obtención de cristales proporcionaron información estructural precisa de la VP. Los espectros de NMR de la VP en estado de reposo y su complejo con cianuro mostraron que el entorno del hemo de la VP es similar al de otras peroxidasas y permitieron predecir un potencial redox superior al de las peroxidasas procariotas o de plantas pero inferior al de las peroxidasas ligninolíticas de Phanerochaete chrysosporium. Además los espectros de 2+NMR durante la titulación de la VP con Mn sugirieron la existencia de un único sitio de unión de este catión situado en las proximidades de los propionatos del hemo. La estructura cristalográfica, que fue resuelta con una resolución de 1,13 Å (mayor que la descrita para otras peroxidasas), muestra que el plegamiento terciario de la VP es similar al de otras peroxidasas ligninolíticas, como la lignina peroxidasa y la manganeso peroxidasa, o de secreción de plantas, como la peroxidasa de rábano. La estructura incluye 11 hélices, 4 puentes disulfuro, 2 calcios estructurales, y un grupo hemo de tipo b situado en la cavidad central. El análisis detallado permitió determinar además la localización de ciertos aminoácidos que podrían ser funcionalmente relevantes. Utilizando el sistema de expresión heteróloga desarrollado se llevó a cabo la mutagénesis dirigida de tres de estos residuos, y se estudiaron las variantes obtenidas. Los resultados han permitido confirmar el sitio de unión 2+de Mn propuesto a partir de los datos de NMR, que se encuentra situado cerca del propionato interno del hemo, así como la implicación de un triptófano superficial en la oxidación de sustratos aromáticos como el VA, que tendría lugar a través de una ruta de transferencia electrónica de largo recorrido. Sin embargo, no se han obtenido evidencias de que algún sustrato se oxide en la zona del canal de acceso al hemo tal como ocurre en las peroxidasas de plantas.

Beca del programa FPI del Ministerio de Educación y Cultura. Proyecto (CYCIT BIO96-0393). Proyecto europeo (QLK3-99-590).

158 p.-40 fig.-15 tab.

Peer reviewed